Regulation of START domain containing proteins through membrane interaction

Abstract

In mammals, there are 15 proteins that contain a lipid-binding START domain and those that have been characterized are able to transfer lipids between membranes in vitro. A prerequisite for START domains to act as lipid carriers is the interaction of the protein with cellular membranes. The goal of this thesis was to investigate how membrane targeting of these START domaincontaining proteins is regulated and affects protein function. Three START family members were studied in greater detail: StarD10, CERT/StarD11 and DLC1/StarD12. StarD10 is a minimal START domain protein with no additional targeting sequences, which was previously shown to transfer phosphatidylcholine (PC) and to a lesser extent phosphatidylethanolamine (PE) in vitro. By mass spectrometry, we identified a novel phosphorylation site in StarD10 at serine 284. We were able to show that casein kinase II mediated phosphorylation of this site reduced lipid transfer in vitro and membrane binding in vivo. However, the intracellular route of lipid transfer by StarD10 still remains to be determined. By contrast, the ceramide transfer protein CERT is known to shuttle ceramide from the endoplasmatic reticulum (ER) to the Golgi complex. Targeting to these organelles is mediated via the FFAT motif that binds to the ER-resident protein VAP and the PH domain that binds phosphatidylinositol-(4)-phosphate (PI(4)P) enriched in Golgi membranes. Here we identified CERT as a novel substrate for Protein Kinase D (PKD) at the Golgi. PKD-mediated phosphorylation at serine 132 is shown to reduce the PH domain-dependent interaction of CERT with PI(4)P-containing membranes and ceramide transfer. Thus, membrane binding of both StarD10 and CERT is negatively regulated by phosphorylation and this results in decreased lipid transfer efficiency. The tumor suppressor protein DLC1 (Deleted in Liver Cancer 1) is a Rho GTPase activating protein (GAP), which contains a START domain of unknown specificity and function. Through its GAP domain DLC1 inactivates the small GTPase RhoA to control actin cytoskeletal remodeling and biological processes such as cell migration and proliferation. In this thesis, DLC1 was found to interact with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) through a previously unrecognized polybasic region (PBR). Interestingly, PI(4,5)P2-containing membranes enhanced DLC1 RhoGAP activity in vitro. In living cells, a DLC1 mutant lacking an intact PBR inactivated Rho signaling less efficiently and was severely compromised in suppressing cell spreading, directed migration and proliferation. PI(4,5)P2 thus appears to be an important cofactor in DLC1 regulation in vivo. The PBR, however, was not sufficient to recruit DLC1 to membranes and its deletion did not alter DLC1 subcellular localization. Instead, we provide evidence for alternative mechanisms towards the regulation of DLC1 localization. DLC1 interaction with the lipid phosphatase PTEN may contribute to plasma membrane localization, while interaction with 14-3-3 adaptor proteins sequesters the protein in the cytoplasm.

In Säugern sind 15 Proteine mit einer lipidbindenden START-Domäne bekannt. Die bislang charakterisierten Mitglieder dieser Proteinfamilie können Lipide in vitro zwischen Membranen transportieren. Um ihre Transportfunktion auszuüben, müssen START-Domänen-Proteine mit Zellmembranen direkt wechselwirken. Das Ziel der Arbeit war es aufzuklären, wie diese Wechselwirkung mit Membranen reguliert wird und ob sie eine Auswirkung auf die Proteinfunktion hat. Drei Proteine mit START-Domäne wurden näher untersucht: STARD10, CERT/StarD11 und DLC1/StarD12. StarD10 ist ein „minimales“ START-Domänen-Protein, welches keine weiteren lokalisationsmotive besitzt. Es wurde bereits gezeigt, dass StarD10 in vitro Phosphatidylcholin (PC) und in geringerem Maße Phosphatidylethanolamin (PE) transportiert. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen haben wir Serin 284 als eine neue Phosphorylierungsstelle in StarD10 identifiziert. Phosphorylierung dieses Serins durch Casein-Kinase II führte zu einer Abnahme des Lipidtransports in vitro und reduzierte die Membranbindung des Proteins in vivo. Zwischen welchen zellulären Membranen der StarD10-vermittelte lipidtransfer erfolgt, ist jedoch noch unbekannt. Hingegen ist das Ceramidtransferprotein CERT für den Transport von Ceramid vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) zum Golgi-Komplex verantwortlich. CERT assoziiert über ein FFAT-Motiv mit dem ER-ständigen VAP-Protein, während die PH-Domäne an Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI(4)P) bindet, welches in Golgi-Membranen angereichert ist. Wir konnten zeigen, dass CERT als Substrat der Proteinkinase D (PKD) am Golgi-Komplex dient. PKD-vermittelte Phosphorylierung an Serin 132 verminderte sowohl die PH-Domänen-abhängige Bindung des Proteins an PI(4)P-haltige Membranen als auch den Ceramidtransport. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Membranbindung von StarD10 und CERT durch Phosphorylierung negativ reguliert wird und dies zur Reduktion ihrer Lipidtransferaktivitäten führt. Das Tumorsuppressor-Protein Deleted in Liver Cancer 1 (DLC1) ist ein GTPase-inaktivierendes Protein (GAP), das eine START-Domäne besitzt, deren Ligand und Funktion noch nicht identifiziert worden sind. Durch seine GAP-Domäne inaktiviert DLC1 kleine GTPasen der Rho-Familie und beeinflusst so die Remodellierung des Aktin-Zytoskeletts und biologische Prozesse wie Zellmigration und Zellproliferation. In dieser Arbeit konnte in DLC1 eine bisher unbekannte basische Region (PBR) identifiziert werden, über die das GAP-Protein mit dem Lipid Phosphatidylinositol-(4,5)-Biphosphat (PI(4,5)P2) interagiert. Die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion konnte sowohl in zellfreien Systemen also auch in lebenden Zellen aufgezeigt werden: Die Anwesenheit von PI(4,5)P2-angereicherten Membranen steigerte die RhoGAP-Aktivität von DLC1 in vitro. Darüberhinaus wurde in lebenden Zellen die Rho-abhängige Signaltransduktion durch eine DLC1 Mutante, in der die PBR deletiert war, weniger stark reduziert als durch das Wildtyp-Protein. Weiterhin war diese Deletionsmutante in ihrer Aktivität hinsichtlich der Unterdrückung von Zellausbreitung, gerichteter Migration und Proliferation stark eingeschränkt. PI(4,5)P2 ist somit ein wichtiger Kofaktor der Regulation von DLC1-Aktivität. Interessanterweise war die PBR weder für die Rekrutierung von DLC1 an Membranen ausreichend, noch war die subzelluläre Verteilung von DLC1 durch die Deletion der PBR verändert. Stattdessen haben wir Hinweise dafür, dass die Lokalisation von DLC1 über andere Mechanismen geregelt wird. Die Bindung an die Lipidphosphatase PTEN könnte zur Rekrutierung von DLC1 an die Plasmamembran beitragen, während 14-3-3 Adaptorproteine DLC1 im Zytosol sequestrieren.