Antiestrogens induce TGFß-mediated immunosuppression in breast cancer

Abstract

Antiestrogens (AE) like tamoxifen belong to the most commonly used drugs in the therapy of estrogen receptor positive (ER+) breast cancer. Nevertheless, relapses frequently occur during treatment indicating development of drug resistance. Concerning the underlying mechanisms, the finding of AE induced TGFß in breast cancer cells appears to be relevant both with respect to TGFß’s cell autonomous function as a mediator of cancer progression and its function as an immune regulator. To investigate the potential role of tumor derived, AE induced TGFß as a suppressor of the host’s immune response, different in vitro assays have been established in this work. First, a coculture system comprising the hormone sensitive, human breast cancer cell line MCF-7 and primary lymphocytes from healthy female donors was developed. Treatment of MCF-7 cells with either 4-hydroxytamoxifen (OHT), an active metabolite of the prodrug tamoxifen, or fulvestrant/ICI 182.780 (ICI) caused mRNA downregulation of effector molecules like perforin (PRF1), granzyme B (GzmB) and Fas ligand (FasL) in activated cytotoxic CD8+ T cells. These results were confirmed by western blot analysis. The same coculture system revealed an increase in Foxp3 mRNA expression in naïve CD4+ T cells, when MCF-7 cells were treated with OHT or ICI. To exclude transient, activation induced expression of Foxp3 mRNA without development of regulatory T cells (Treg), CD4+ T lymphocytes from MCF-7 cell cocultures were assessed in a suppressor assay with freshly isolated autologous T helper cells. Activation induced proliferation was significantly reduced by T cells from AE treated cocultures as seen by BrdU incorporation. All effects were reversible with a TGFß neutralizing antibody. Moreover, a direct impact of AE on the expression of the investigated lymphocyte molecules could be excluded. To assess the implications of these results on lymphocyte function, heterologous mixed lymphocyte tumor reactions (MLTR) with MCF-7 cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or subpopulations were performed. Application of AE strongly reduced the cytotoxicity of immune cells in a TGFß dependent manner, as suggested by a reversal of this effect using a neutralizing antibody. Finally, an autologous MLTR was established. To this end, tissue from primary mammary carcinomas was processed into standardized slices or was used to isolate epithelial cell adhesion molecule positive (EpCAM+) tumor cells, which were taken into culture. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) were isolated from the same sample for reactivation with interleukin-2 and subsequent application as effector cells. The AE treatment of tumor cells and slices gave rise to enhanced Foxp3 expression of TIL/PBMC and decreased the number of apoptotic tumor cells as seen in a TUNEL assay. A TGFß neutralizing antibody reversed these effects. The work at hand thus provides evidence for an AE treatment induced, TGFß driven immunosuppression in the tumor microenvironment, a mechanism that could critically contribute to development of AE resistance during therapy.

Antiestrogene (AE) wie Tamoxifen haben sich seit vielen Jahren in der Behandlung des Estrogen-Rezeptor positiven (ER+) Mammakarzinoms bewährt. Allerdings legen häufig auftretende Rückfälle während längerer Einnahme das Entstehen von Resistenzen gegen die Therapie nahe. Die Entdeckung, dass AE den Wachstumsfaktor TGFß in Brustkrebszellen induzieren, hat sich bei der Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen solcher Resistenzen als sehr hilfreich erwiesen. Neben direkten, sowohl tumorfördernden, als auch tumorhemmenden Effekten auf maligne Zellen, kann TGFß auch eine wichtige Rolle in der Modulation und Suppression der gegen den Tumor gerichteten Immunantwort innehaben. Um letzteres im Rahmen der AE-Wirkung zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Zellkultur-Versuche durchgeführt. Zunächst wurde ein Kokultursystem entwickelt, um die Wirkung von AE-behandelten Tumorzellen auf die Expression von Effektormolekülen in Lymphozyten zu analysieren. Die Behandlung der hormonsensitiven Brustkrebs Zelllinie MCF-7 mit den AE 4-Hydroxy-Tamoxifen (OHT) oder Fulvestrant/ICI 182.780 (ICI) führte zu einer Herabregulierung zytotoxischer Effektormoleküle, wie Perforin, Granzym B und dem Fas Liganden in kokultivierten CD8+ T-Zellen. Dieser Effekt wurde sowohl für die mRNA, als auch die entsprechenden Proteine gezeigt. Analog wurde eine erhöhte Transkription des für die Differenzierung regulatorischer T-Zellen (Treg) verantwortlichen Transkriptionsfaktors Foxp3 in CD4+ T-Zellen nach AE-Behandlung der MCF-7 Zellen nachgewiesen. Die resultierende T-Zell-Population verminderte die Proliferation aktivierter autologer CD4+ T-Zellen, was anhand von BrdU-Einbau in neusynthetisierte DNA gemessen wurde. Bei der Aufklärung dieser Effekte konnte der direkte Einfluss durch AE auf die Lymphozyten zu Gunsten einer TGFß-abhängigen Regulierung ausgeschlossen werden. Um die Wirkung von AE-induziertem TGFß in den MCF-7 Zellen auf die Funktion von Immunzellen aufzudecken, wurde ein heterologer zellbasierter Zytotoxizitätstest (mixed lymphocyte tumor reaction, MLTR) durchgeführt. Die Fähigkeit MCF-7 Zielzellen abzutöten war sowohl in der Gesamtpopulation peripherer, mononukleärer Blutzellen (PBMC), als auch in isolierten CD8+ T-Lymphozyten oder natürlicher Killer (NK) Zellen stark herabgesetzt, wenn die Tumorzellen mit AE behandelt wurden. Die Zugabe eines TGFß neutralisierenden Antikörpers führte zur Aufhebung dieses Effekts. Für eine autologe MLTR wurden aus primären Mammakarzinomen genormte Gewebsschnitte hergestellt und in Kultur genommen. Zugleich wurden sowohl Tumorzellen mittels des spezifischen Oberflächenmarkers EpCAM (epitheliales Zelladhäsionsmolekül), als auch Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) aus der gleichen Probe isoliert. Letztere kamen als Effektorzellen zum Einsatz, nachdem sie mit Interleukin-2 stimuliert, bzw. reaktiviert wurden. Während der autologen MLTR mit Tumorschnitten oder –zellen kam es unter AE-Behandlung zu einem Anstieg der Foxp3 mRNA in TIL, was eine erhöhte Entstehungsrate von immunsuppressiven Treg-Zellen nahelegt. Diese Hypothese untermauernd konnte in einer anschließenden TUNEL-Färbung der Nachweis erbracht werden, dass in den AE-behandelten MLTR-Ansätzen weniger Tumorzellen durch Apoptose abgetötet werden. Auch hier wurde die Umkehrbarkeit durch einen neutralisierenden TGFß Antikörper demonstriert. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für die These, dass die Therapie mit AE zu einer TGFß-vermittelten Unterdrückung des Immunsystems in der unmittelbaren Umgebung des Tumors führen kann. Der hieraus resultierende Überlebensvorteil für den Tumor kann wesentlich zur Entstehung einer AE-Resistenz während der Behandlung beitragen.