Improvement of pharmacokinetics of small recombinant bispecific antibody molecules

Abstract

Der Fortschritt im Protein-Engineering der letzten zwei Jahrzehnte führte zur Entwicklung einer Vielzahl von kleinen rekombinanten Antikörperkonstrukten für die Tumortherapie. Die herkömmlichen therapeutisch eingesetzten Antikörper sind meist vom Typ IgG. Kleine Antikörperformate haben gegenüber diesen IgGs verbesserte Eigenschaften. Durch ihre geringe Größe verteilen sie sich schneller und gleichmäßiger in soliden Tumoren. Außerdem haben sie keinen Fc-Teil und verursachen daher auch keine Fc-vermittelten Nebenwirkungen. Zudem lassen sie sich bakteriell und damit ökonomischer herstellen. Ein Nachteil der kleinen Antikörperformate ist, dass sie nur eine kurze Zirkulationsdauer im Organismus aufweisen. Durch ihren geringen hydrodynamischen Radius werden sie schnell über die Niere ausgeschieden. Außerdem werden kleine Antikörperformate schneller abgebaut, da ihnen der Fc-Teil fehlt, über den IgGs nach der Endozytose wieder in den Blutstrom recycelt werden. Die kurze Zirkulationsdauer der kleinen Antikörperformate reduziert ihre Wirksamkeit und macht häufige Infusionen nötig. Das führt zu hohen Kosten und schränkt die Lebensqualität der Patienten ein. Die vorliegende Studie hatte das Ziel, die Pharmakokinetik eines bispezifischen single-chain Diabodys (scDb) zu verbessern, der gegen das tumorassoziierte Antigen CEA und das T-Zellrezeptormolekül CD3 gerichtet ist. Mit der Fähigkeit beide Antigene zu binden, ist der scDb in der Lage, zytotoxische T-Zellen zu CEA positiven Tumorzellen zu rekrutieren. Drei unterschiedliche Strategien zur Verbesserung der Pharmakokinetik werden in dieser Studie verglichen: N-Glykosylierung, PEGylierung und die Fusion mit einer bakteriellen albuminbindenden Domäne (ABD). N-Glykosylierung und PEGylierung haben zum Ziel, den hydrodynamischen Radius des scDb zu vergrößern und damit die renale Ausscheidung zu verringern. Die Fusion mit der ABD soll zusätzlich das FcRn vermittelte Recycling des scDb-ABD-Albumin-Komplexes ermöglichen, denn entsprechend den IgGs, wird auch Albumin nach der Endozytose über den neonatalen Fc-Rezeptor (FcRn) recycelt. Für die N-Glykosylierungsstrategie wurden drei Derivate des scDb mit 3, 6 oder 9 N-Glycosylierungsstellen (Sequons) produziert. Die N-Glycosylierungen führten zu einer mäßigen Vergrößerung des hydrodynamischen Radius. Die Verbesserung der Zirkulationszeit fiel mit einer 2- bis 3-fach vergrößerten AUC(0-24h) moderat aus. Im Gegensatz dazu führte die Konjugation des scDb mit PEG 40kDa zu einer ~ 3-fachen Vergrößerung des hydrodynamischen Radius und resultierte in einer drastisch verlängerten Zirkulationsdauer. Die längste Zirkualtionsdauer mit einer 14-fach vergrößerten AUC(0-24h) wurde für den scDb-ABD beobachtet. Durch den Vergleich seiner Halbwertszeit in Wildtyp- und in FcRn-Knockout-Mäusen konnte der Einfluss des FcRn vermittelten Recyclings auf die verlängerte Zirkulationsdauer des scDb-ABD nachgewiesen werden. Durchflusszytometrische Messungen von titriertem scDb und seiner modifizierten Derivate auf CEA+ oder CD3+ Zellen zeigten, dass die Antigenbindung des scDbCEACD3 nicht oder nur marginal durch die Modifikationen beeinflusst wurde. Allerdings ergab ein T-Zell-Aktivierungs-Assay, dass das Potential der Derivate T-Zellen zu aktivieren 3- bis 12-fach reduziert war. Im Fall des scDb-ABD zeigte sich diese Reduktion besonders in Anwesenheit von Albumin, was darauf hinweist, dass der große scDb-ABD-Albumin-Komplex sterisch die Effektorzell-Zielzell-Interaktion behindert. Der negative Einfluss der Albuminbindung auf die Bioaktivität des scDb-ABD spiegelte sich auch in Zytotoxizitäts-Assays wider. Die Analyse der Organverteilung des scDb und seiner Derivate zeigte, dass die verlängerte Zirkulationsdauer des scDb-ABD und des PEGylierten scDb zu einer verstärkten Akkumulation der Antiköperkonstrukte in CEA+ Tumoren führt. Dabei weist scDb-ABD eine ~ 2-fach höhere Tumorakkumulation als der PEGylierte scDb auf, obwohl die Serum-Halbwertszeiten der beiden Konstrukte in diesem Mausmodell ähnlich sind. Die vorliegende Studie zeigt, dass die Fusion mit der ABD ein vielversprechender Ansatz ist, um die Pharmakokinetik von kleinen rekombinanten Antikörperkonstrukten zu verbessern. Weitere Studien müssen zeigen, inwiefern die verbesserte Tumorakkumulation die antitumorale Wirksamkeit der modifizierten Antiköper in vivo verbessert.

The progress in protein engineering of the last two decades led to the development of a variety of small recombinant antibody formats for tumor therapy. These small formats show improved properties compared to the conventional monoclonal antibodies which are commonly IgGs. Small recombinant antibodies penetrate solid tumors more homogenously, cause less side effects for lacking the Fc-region and can be produced more economically in bacteria. However, they exhibit a shorter circulation half-life than IgGs. They are rapidly cleared by renal filtration because of their small size and their lack of the Fc-region, which mediates the recycling after cellular uptake by the neonatal Fc-receptor (FcRn). The short circulation half-life of small antibody formats reduces their anti-tumor efficacy and necessitates frequent infusions, leading to high costs and patient inconvenience. The present study aims at the improvement of pharmacokinetics of a bispecific single-chain diabody (scDb) directed against the tumor-associated antigen CEA and the T-cell receptor complex molecule CD3. Therefore, it is able to retarget cytotoxic T-cells to CEA+ tumor cells. Three basically different strategies are compared in this study to improve the pharmacokinetics of scDbCEACD3: N-glycosylation, PEGylation and fusion to a bacterial albumin-binding domain (ABD). N-glycosylation and PEGylation of the scDb aim at an increased hydrodynamic radius and thereby reduced renal clearance. The fusion of the scDb to ABD has an additional effect: As well as IgG, albumin is recycled by the FcRn. Bound to albumin, scDb-ABD can exploit this mechanism and be recycled after cellular uptake. For the N-glycosylation three different derivatives with 3, 6 or 9 N-glycosylation sites (sequons) were engineered, resulting in a moderate enlargement of the scDb, which translated in a moderately prolonged serum half-life. In contrast, PEGylation of the scDb with a large, branched PEG 40 kDa led to a ~ 3-fold enlargement of the hydrodynamic radius, resulting in a drastically increase of the circulation time. The longest circulation time with a ~ 14-fold increased area under the curve (AUC) was observed for scDb-ABD. By comparing its half-life in FcRn heavy chain knockout and in wild-type mice, the contribution of the FcRn-mediated recycling on the prolonged serum half-live of scDb-ABD could be confirmed. Titration of scDb and its derivatives in flow cytometry on CEA+ or CD3+ cells revealed no or only marginal influence of the modifications on antigen-binding. However, a 3- to 12-fold decrease was observed in their ability to activate T-cells, as measured by IL-2 release. For scDb-ABD, the reduced potential for T-cell activation was especially observed in presence of albumin, implicating that the large scDb-ABD-albumin complex complicates the target cell - effector cell interaction. A cytotoxicity assay using CEA+ target cells and preactivated PBMC revealed that the ability of scDb-ABD to mediate cytotoxicity was also reduced especially in presence of albumin. Finally, biodistribution studies in tumor bearing nude mice showed that the prolonged half-lives of scDb-ABD and the PEGylated scDb translate in improved accumulation in CEA+ tumors. Although the serum half-lives of both constructs were similar in this mouse model, tumor accumulation of scDb-ABD was ~ 2-fold higher than tumor accumulation of the PEGylated scDb, making the fusion with ABD a promising approach for the improvement of pharmacokinetics of small recombinant bispecific antibodies. Further studies have to investigate how the improved tumor accumulation translates into anti-tumor efficacy in vivo.