Phenocopy : a strategy to qualify chemical compounds during hit-to-lead and/or lead optimization

Abstract

A phenocopy is defined as an environmentally induced phenotype of one individual which is identical to the genotype determined phenotype of another individual. In the present work, the phenocopy phenomenon has been translated to the drug discovery process as phenotypes produced by the treatment of cellular systems with small interfering RNAs (siRNAs) or new chemical entities (NCE) may resemble environmentally induced phenotypic modifications. Various new chemical entities exerting inhibition of the kinase activity of Transforming Growth Factor Beta Receptor I (TGF-betaR1) were ranked by high-throughput RNA expression profiling. This chemical genomics approach was able to unravel both on-target effects (effects, caused by the inhibition of the drug target) and off-target effects (effects, caused by the interaction of the NCE with additional molecules). It resulted in a precise time-dependent insight into the TGF-beta biology (referred to as on-target signature) and allowed furthermore a comprehensive analysis of each NCE's off-target effects (re-ferred to as off-target signatures). Both signature types can support the drug discovery process. The on-target signature helps to characterize the mode of action of the drug target (TGF-betaR1) and thereby supports the target validation as well as the assay development process. Furthermore, the evaluation of off-target effects by the Phenocopy approach allows a more accurate and integrated view on the mode of action of the compounds, supplementing classical biological evaluation parameters such as potency and selectivity. The presented proof of concept study allowed the ranking of NCEs that were before indistinguishable solely based on potency and selectivity. According to the newly introduced criteria, several of the tested NCEs revealed liabilities at e.g. the induction of off-target effects and of induction of gene regulation inverse to the desired TGF-beta inhibition effect, at the induction of cell death, at acting as pro-inflammatory stimuli and as promoting cellular growth and at induction of cancer pathways. Ultimately, this approach has therefore the potential to become a novel method for ranking compounds during various drug discovery phases.

Eine Phänokopie ist als ein Individuum definiert, dessen Phänotyp durch einen Umwelteinfluss mit dem eines anderen Individuums identisch ist, dessen Phänotyp durch seinen Genotyp bestimmt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde das Phänokopiephänomen auf den Wirkstoffentwicklungsprozess übertragen. Hierbei wurden die speziellen Phänotypen in einem Zellsystem durch die Behandlung mit "new chemical entities" (NCE), potentiellen neuen Wirkstoffkandidaten, oder mittels "small interfering RNAs" (siRNAs) induziert. Somit können beide Molekülklassen als externe Umweltbedingung angesehen werden. Hierbei wurden diverse der potentiellen Wirkstoffkandidaten zur Inhibition der Kinaseaktivität von Transforming Growth Factor Beta Receptor I (TGF-betaR1) mittels Hochdurchsatz-Expressionsprofilierung klassifiziert. Dieser „chemical genomics“ Ansatz war in der Lage, sowohl die On-target Effekte (Effekte, welche durch die Inhibition des Wirkstofftargets aus-gelöst werden), als auch die Off-target Effekte (Effekte, welche durch die Interaktion des NCEs mit zusätzlichen Molekülen ausgelöst werden) zu identifizieren. Weiterhin ermöglichte er präzise, zeitlich aufgelöste Einblicke in die TGF-beta Biologie (im Folgenden als On-target Signatur bezeichnet) und erlaubte eine umfassende Analyse der jeweiligen Off-target Effekte der Wirkstoffkandidaten (im Folgenden als Off-target Signatur bezeichnet). Beide Signaturtypen können zur Unterstützung des Wirkstoffentwicklungsprozesses herangezogen werden. Die On-target Signatur charakterisiert die Wirkungsweise des Wirkstoffziels (target) und unterstützt somit sowohl den "target validation" Prozess, als auch den "assay development" Prozess. Des Weiteren erlaubt das Ermitteln der Off-target Effekte durch den Phänokopieansatz einen präzisen und ganzheitlichen Einblick in die Wirkungsweise der Wirkstoffkandidaten und ergänzt klassische, biologische Bewertungsparameter wie Wirksamkeit und Selektivität. Die hier präsentierte Machbarkeitsstudie ermöglicht die Klassifizierung von Wirkstoffkandidaten, die zuvor auf der Basis von Wirksamkeit und Selektivität nicht zu unterscheiden waren. Entsprechend der neu eingeführten Kriterien zeigen verschiedene der getesteten Wirkstoffkandidaten unterschiedliche Vorbelastungen, wie z.B. das Auslösen von Off-target Effekten und von Genregulation, welche gegenläufig zu dem gewünschten TGF-beta Inhibitionseffekt verlaufen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass manche NCEs Zelltod induzieren, als proinflammatorische Stimuli fungieren, das Zellwachstum steigern könnten und Krebssignalwege induzieren. Letztendlich hat dieser Ansatz somit das Potential eine neue Methode zur Klassifizierung von neuen Wirkstoffkandidaten, während verschiedenster Phasen des Wirkstoffentwicklungsprozesses, zu werden.