Die enzymatische Hydrolyse von Nitrilen unter sauren Bedingungen durch neu isolierte und rekombinante Mikroorganismen und die Verwendung von säuretoleranten Ganzzellbiokatalysatoren zur enantioselektiven Synthese von α-Hydroxycarbonsäuren

Abstract

Enantiomerenreine &#945;-Hydroxycarbonsäuren stellen bedeutende Ausgangsstoffe für die Synthese einer Vielzahl von (chiralen) Verbindungen dar. Die enzymatische Umsetzung von &#945;-Hydroxy-nitrilen stellt eine Möglichkeit zur enantioselektiven Synthese von &#945;-Hydroxycarbonsäuren dar. Hierbei können entweder racemische oder enantiomerenreine &#945;-Hydroxynitrile als Ausgangssubstrate dienen. Die Enantiomerenüberschüsse der Produkte dieser Biotransformationen werden durch die Instabilität der &#945;-Hydroxynitrile in wässrigen Medien und die spontane chemische Hydrocyanierung der Zerfallsprodukte limitiert. Diese unerwünschten Nebenreaktionen können durch die Verwendung saurer Reaktionsmedien unterdrückt werden. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die enzymatische Hydrolyse von Nitrilen unter sauren Bedingungen untersucht. Das Ziel war es hierbei, die enantioselektive Synthese von (S)-&#945;-Hydroxycarbonsäuren ausgehend von Aldehyden und Cyanid zu ermöglichen. Als Modellreaktion wurde die Synthese von (S)-Mandelsäure angestrebt. Anfängliche Stabilitätstest zeigten, dass Mandelonitril in wässrigen Medien bei pH-Werten <5 weitgehend stabil vorliegt. Daher wurde die Biotransformation von Mandelonitril bei pH-Werten &#8804;5 untersucht. Als Biokatalysator wurde E. coli JM109(pIK9) eingesetzt, der eine Arylacetonitrilase aus Pseudomonas fluorescens EBC191 rekombinant synthetisiert. Ruhezellen und Rohextrakte von E. coli JM109(pIK9) setzten Mandelonitril bei pH-Werten von 4-7 zu Mandelsäure und Mandelsäureamid um. Ruhezellen hydrolysierten Mandelonitril mit signifikant höheren Aktivitäten als Rohextrakte und setzten Mandelonitril in Konzentrationen &#8804;150 mM um. Es konnte somit deutlich gezeigt werden, dass die eingesetzten E. coli Ganzzell-Katalysatoren prinzipiell für die angestrebte Biotransformation geeignet sind. Die Arylacetonitrilase aus P. fluorescens EBC191 wurde zum Vergleich auch in der säuretoleranteren Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ruhezellen des rekombinanten Stamms setzten Mandelonitril bei pH 3-7 um. Die simultane Expression der (S)-Oxynitrilase aus Maniok (Manihot esculenta) und der Arylacetonitrilase aus P. fluorescens EBC191 in P. pastoris führte zu einem “bienzymatischen Ganzzellkatalysator“, welcher die Transformation von Benzaldehyd und KCN zu (S)-Mandelsäure und (S)-Mandelsäureamid bei pH 3,8 katalysierte. Es wurden Anreicherungen bei pH 3 und 4 mit Phenylacetonitril als Stickstoffquelle durchgeführt. Hierbei wurden Inokula aus verschiedenen sauren Biotopen verwendet. Es wurde ein neues Isolat der „schwarzen Hefe“ Exophiala oligosperma angereichert, das Phenylacetonitril als einzige Stickstoff-, Kohlenstoff und Energiequelle nutzen konnte. E. oligosperma R1 setzte Phenylacetonitril zu Phenylessigsäure um und metabolisierte dieses Intermediat über 2-Hydroxyphenylessigsäure zu Homogentisat, welches dann zu Maleylacetoacetat oxidiert wurde. Ruhezellen von E. oligosperma R1 hydrolysierten Phenylacetonitril bei pH-Werten von 1,5-9. Phenylacetonitril wurde von E. oligosperma R1 wahrscheinlich durch eine Nitrilase umgesetzt. Die höchsten Nitrilase-Aktivitäten wurden nach Anzucht des Organismus in Gegenwart von 2-Cyanopyridin erreicht. Rohextrakte aus derart induzierten Zellen setzten eine Vielzahl unterschiedlich ringsubstituierter Benzonitrile, Phenylacetonitrile, Cyanopyridine, sowie Mandelonitril, Phenylpropionitril und Acrylonitril zu den korrespondierenden Carbonsäuren um. Spuren von Carbonsäureamiden konnten nur in wenigen Umsätzen nachgewiesen werden. Der Vergleich der Nitrilase-Aktivität von E. oligosperma R1 mit verschiedenen anderen Nitrilasen aus Pilzen zeigte, dass die Nitrilase aus E. oligosperma R1 ein breiteres Spektrum an Nitrilen hydrolysierte. Die potentielle Nutzbarkeit des neuen Biokatalysators wurde durch den Umsatz von 2-Hydroxy-3-butennitril zu 2-Hydroxy-3-butensäure durch Ruhezellen von E. oligosperma R1 bei pH 4 verifiziert.

Enantiomerically pure &#945;-hydroxycarboxylic acids are important precursors for the synthesis of a variety of (chiral) compounds. They can be synthesized by the enzymatic conversion of &#945;-hydroxynitriles. For that purpose either racemic or enantiomerically pure &#945;-hydroxynitriles can be used as starting substrates. The enantiomeric excess of the products of these biotransformations is limited by the instability of &#945;-hydroxynitriles in aqueous media and the spontaneous chemical hydrocyanation of the decay products. These adverse reactions can be suppressed by the use of acidic reaction media. Therefore, in the present thesis the enzymatic hydrolysis of nitriles under acidic conditions was investigated. The aim of the study was to enable the enantioselective synthesis of (S)-&#945;-hydroxycarboxylic acids starting from aldehydes and cyanide under acidic conditions. As a model reaction, it was aspired to synthesize (S)-mandelic acid from benzaldehyde plus cyanide. Initial stability tests demonstrated that mandelonitrile was almost stable in aqueous media at pH-values <5. Therefore, the biotransformation of mandelonitrile was investigated at pH-values &#8804;5. E. coli JM109(pIK9) which is recombinantly synthesizing an arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191, was used as biocatalyst. Resting cells and crude extracts of E. coli JM109(pIK9) converted mandelonitrile at pH-values of 4-7 to mandelic acid and mandeloamide. Resting cells hydrolyzed mandelonitrile with significantly higher activities than crude extracts and converted mandelonitrile in initial concentration &#8804;150 mM. Thus, it could be clearly shown that E. coli whole-cell catalysts are in principle suited for the desired biotransformation. For comparison, the arylacetonitrilase from P. fluorescens EBC191 was also expressed in the acidotolerant yeast Pichia pastoris. Resting cells of the recombinant strain converted mandelonitrile at pH 3-7. The simultaneous expression of the (S)-oxynitrilase from cassava (Manihot esculenta) and the arylacetonitrilase from P. fluorescens EBC191 in P. pastoris finally resulted in a "bienzymatic whole-cell catalyst", which catalyzed the transformation of benzaldehyde and KCN to (S)-mandelic acid and (S)-mandeloamide at a pH-value of 3.8. Enrichments cultures were performed at pH-values of 3 and 4 with phenylacetonitrile as sole source of nitrogen. The inocula were taken from various acidic habitats. The enrichments resulted in the isolation of the "black yeast" Exophiala oligosperma R1, which was able to use phenylacetonitrile as sole source of nitrogen, carbon and energy. E. oligosperma R1 metabolized phenylacetonitrile to phenylacetic acid. Phenylacetic acid was converted via 2-hydroxyphenylacetic acid to homogentisate, which was finally oxidized to maleylacetoacetate. Resting cells of E. oligosperma R1 hydrolyzed phenylacetonitrile at pH-values of 1.5-9. E. oligosperma R1 probably converted phenylacetonitrile by the action of a nitrilase. The highest nitrile converting activities were achieved after growing the organism in the presence of 2-cyanopyridine. Crude extracts were prepared from these cells and shown to convert a variety of different ring substituted benzonitriles, phenylacetonitriles, cyanopyridines as well as mandelonitrile, phenylpropionitrile and acrylonitrile to the corresponding carboxylic acids. Only traces of the corresponding amides were detected during the conversion of most nitriles. The nitrilase activity of E. oligosperma R1 hydrolyzed a wider range of nitriles compared to other fungal nitrilases. A potential application of the new biocatalyst was demonstrated by the conversion of 2-hydroxy-3-butenenitrile to 2-hydroxy-3-butenoic acid by resting cells of E. oligosperma R1 at pH 4.