Globale Metabolomanalyse von Corynebacterium glutamicum : Chancen und Herausforderungen der Gaschromatographie-Massenspektrometrie für das Metabolic Fingerprinting

Abstract

Metaboliten sind niedermolekulare (<1000 Da), organische Verbindungen, die an Stoffwechselreaktionen beteiligt sind. Analog zum Genom oder Proteom bezeichnet man die Gesamtheit aller Metaboliten eines biologischen Systems als Metabolom. Für die wissensbasierte Optimierung industrieller Produktionsstämme ist die Metabolomanalyse eine wichtige Grundlage. Ein aus biotechnologischer Sicht besonders interessanter Organismus ist Corynebacterium glutamicum. Die Produktion von Aminosäuren mit genetisch modifizierten Corynebacterium-Stämmen gehört, bezogen auf die jährlich produzierte Menge, zu den wichtigsten biotechnologischen Prozessen. Aminosäuren werden als Futtermittelzusatz, Geschmacksverstärker und Massenprodukt für pharmazeutische Anwendungen benötigt. Deshalb wird ein tieferes Verständnis des Stoffwechsels und seiner Regulation angestrebt. Für die Metabolomanalyse kommen zahlreiche analytische Methoden zum Einsatz. Von diesen wird die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) allgemein als der Goldstandard bezeichnet. Aufgrund der Trennleistung eignet sich diese Methode zur Trennung komplexer Gemische, wie Zellextrakten. Auf der Seite des Massenanalysators werden meistens Flugzeitmassenspektrometer (Time-Of-Flight, TOF) verwendet. Sie kombinieren eine hohe Scanrate mit einer akkuraten Massenbestimmung über einen weiten Massenbereich (bis mehr als m/z 1000). In dieser Arbeit wurde eine semi-quantitativen GC-MS Analytik etabliert und das Metabolommuster in Zellextrakten von C. glutamicum im ungerichteten Ansatz (metabolic fingerprinting) abgebildet. Auf Seiten des Massenanalysators wurde dafür die Elektronenstoß-Ionisation eingesetzt, um reproduzierbar Fragmentspektren zu erzeugen und zu identifizieren. Im Zuge der Untersuchungen wurden 90 Metaboliten nach Extraktion der polaren und 22 Metaboliten nach Extraktion der lipophilen Metaboliten zweifelsfrei in den Zellextrakten von C. glutamicum identifiziert. Daneben wurde der in der Literatur beschriebene, hohe Anteil nicht identifizierbarer Peaks in den GC-MS Profilen (~50%) bestätigt. Mit Hilfe der vergleichenden Metabolomanalyse konnten signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Stämmen und über den Wachstumsverlauf des Lysinproduzenten DM1933 aufgezeigt werden. Diese fielen geringer aus als erwartet und beschränkten sich zumeist auf Metaboliten des Zentralstoffwechsels und auf Zwischenprodukte, wie Aminosäuren, die unmittelbar oder mittelbar daraus hervorgehen. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Chemische Ionisation zur Bestimmung der exakten Molekülionenmasse etabliert. Die Identifikation einer mittels GC-MS bestimmten Masse eines unbekannten Analyten geschieht über den Umweg großer Listen aller möglichen, für diese Masse berechneten Summenformeln. Hierfür wurde mit dem Juelich Mass Analyzer (JUMA) eine Softwarelösung entwickelt, die leistungsfähige Filter mit einer virtuellen Entderivatisierung, einer automatischen Klassifizierung der Summenformeln auf der Basis bekannter Analyten und einem multiplen Datenbankabgleich verbindet. Nach erfolgreicher Validierung auf den Massen bekannter Analyten wurde diese Lösung in Kombination mit stabiler Isotopenmarkierung eingesetzt, um die Herkunft der hohen Anzahl nicht identifizierter Massen im Chromatogramm aufzuklären. Insgesamt konnten so 56 zuvor unbekannte Massen als biologisch relevant und 64 weitere eindeutig als Kontaminationen ohne biologische Relevanz identifiziert werden. Mit diesen Arbeiten ist auch die Voraussetzung für den Zugang zu bisher messtechnisch nicht erfassten Analyten bereitet worden.

Metabolites are low-molecular-weight organic compounds (<1000 Da) participating in metabolic reactions. Analogous to the genome or proteome, the complete set of metabolites within a biological system is named the metabolome. The discipline of metabolomics is an increasingly important foundation for a knowledge driven improvement of industrial production strains. A very interesting organism for biotechnological production is Corynebacterium glutamicum. Processes for the production of amino acids with genetically modified strains of the species Corynebacterium are among the most important concerning tonnage. They are needed as feed additives, flavour enhancer and as bulk products for pharmaceutical applications. Therefore, a deeper understanding of the metabolism and its regulation is desired. Many analytical techniques are applied for metabolome analysis. Among them gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) is widely recognized as the gold standard. Due to its separating capacity gas chromatography is a potent technique for the separation of components of a mixture such as cell extracts. On the side of the mass analyzer time-of-flight (TOF) instruments are most commonly used. They combine high scan rates with mass accuracy over a wide mass range (up to m/z 1000 and more). In this work analytical protocols for a semi-quantitative measurement of intracellular metabolites using GC-MS were established. The investigations initially focused on electron ionization resulting in reproducible and characteristic fragmentation patterns of the cellular compounds. The chromatogram typically was dominated by a few very high concentrated compounds. A total of 90 different polar and 22 lipophilic metabolites could be identified in cell extracts of C. glutamicum. In accordance with literature more than 50% of all peaks within the chromatogram could not be identified with this approach. The developed methodology was applied for measuring intracellular metabolites in a holistic manner. This unbiased approach, termed metabolic fingerprinting, was used for the comparative metabolome analysis of different strains of C. glutamicum. The observed differences between the strains were much less pronounced than expected. The same holds true for the investigation of the Lysine-producing strain DM1933 over the time-course of a fed-batch cultivation. In another part of this work chemical ionization, capable of determining the accurate molecular mass with an accuracy of 2-3 mDa was established. Among other things, different ionization gases were tested. Since the direct way from the mass to the molecular formula is obstructed all possible molecular formulas have to be calculated in a first step. The challenge was to find an intelligent filter process to sort out false-positive formulas and to identify the correct one. For this purpose a software solution called Juelich Mass Analyzer (JUMA) was developed and successfully validated. It includes new features specifically accounting for the GC-MS based approach, namely a virtual de-derivatization and a nearest neighbour classification for the suggestion of the substance class of an unknown compound. Combined with stable isotope labelling experiments a total of 64 contaminations and 56 so far unknown compounds with biological relevance were found in the chromatograms and analysed. The majority of the hitherto unknown compounds represent artefacts of the sample preparation procedure.