Structural insights into the proteintranslocase TOM from Neurospora crassa and Homo sapiens

Abstract

The translocase of the outer mitochondrial membrane TOM is responsible for the transport of all nuclear-encoded proteins into mitochondria. The TOM complex consists of several subunits and their composition in fungi, mammals and plants is remarkably similar. Although the subunit composition of the TOM complex is known, its stoichiometry is still a matter of controversy. In this study, the subunit composition, mass, and stoichiometry of purified Neurospora crassa TOM core complex was determined with laser-induced ion desorption coupled to mass spectrometry. The results gave hints about the mode and strength of interaction between single subunits in the TOM complex. The main constituent of the mitochondrial protein translocase TOM is the channel-forming protein Tom40. It belongs to the mitochondrial porin family and represents the only essential subunit of the high molecular mass TOM complex. This study describes the recombinant expression, purification, and folding of two human Tom40 isoforms for structural biology experiments. Secondary structure analyses revealed a dominant beta-sheet structure and a small alpha-helical content in connection with a high thermal stability for both proteins. Channel activity measurements with both Tom40 isoforms in planar lipid bilayers confirmed their functionality as pore proteins. The beta-strands in membrane proteins contribute to an individual degree to the overall stability of the protein fold. To increase the stability of Tom40 for crystallographic studies, the potential energetic contribution of the predicted beta-strands was calculated using bioinformatics tools. In human Tom40, three rather unstable beta-strands in the transmembrane domain were detected in this study. To examine the destabilizing effects of these strands, key amino acids in each of the three strands were substituted by hydrophobic amino acids using site-directed mutagenesis. Thermal stability and solvent denaturation were examined and revealed a significant stabilization of the mutant Tom40. The tendency to oligomerize, which may shield unstable beta-strands, was reduced in the mutant protein. The improved stability of the mutant Tom40 provides a base for crystallographic studies in the future.

Die Translokase der äußeren Mitochondrienmembran TOM ist verantwortlich für den Transport aller kerncodierter Proteine in Mitochondrien. Der TOM-Komplex besteht aus mehreren Untereinheiten, deren Zusammensetzung in Pilzen, Säugern und Pflanzen ausgesprochen ähnlich ist. Obwohl die Anzahl der Untereinheiten im TOM-Komplex bekannt ist, wird ihre Stöchiometrie weiter intensiv diskutiert. In dieser Arbeit wurde die Masse, Zusammensetzung und Stöchiometrie des gereinigten TOM-Komplexes aus Neurospora crassa mit laserinduzierter Ionendesorption, gekoppelt an Massenspektrometrie, analysiert. Außerdem gaben die Ergebnisse Hinweise über die Art und Stärke der Interaktionen zwischen den einzelnen Untereinheiten und deren Organisation im TOM-Komplex. Die Hauptuntereinheit der mitochondrialen Proteintranslokase TOM ist das Kanalprotein Tom40. Es gehört zur Familie der mitochondrialen Porine und ist die einzige essentielle Untereinheit des hochmolekularen TOM-Komplexes. Diese Arbeit beschreibt die rekombinante Expression, Reinigung und Rückfaltung der zwei humanen Tom40-Isoformen für strukturbiologische Untersuchungen. Sekundärstrukturbestimmungen zeigten für beide Proteine eine ausgeprägte beta-Faltblatt Struktur und einen kleinen alpha-helikalen Anteil, verbunden mit einer hohen thermischen Stabilität. Die Kanalaktivität von rekombinantem Tom40 in planaren Doppellipidmembranen bestätigte die native Funktion als Porenprotein. Die transmembranen beta-Stränge in Membranproteinen tragen in unterschiedlicher Weise zur gesamten Stabilität der Proteinfaltung bei. Um die Stabilität von Tom40 für röntgenkristallographische Studien zu erhöhen, wurden die Energielevel für alle vorhergesagten beta-Stränge des Proteins berechnet. Dabei wurden drei instabile Stränge in humanem Tom40 identifiziert, wofür jeweils eine Aminosäure pro Strang verantwortlich war. Um den destabilisierenden Effekt dieser Stränge zu analysieren, wurden diese drei Aminosäuren mittels gerichteter Mutagenese durch hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht. Thermische Analyse und Faltungsverhalten in chaotropen Reagentien zeigten eine signifikante Stabilisierung des mutierten Proteins. Die Oligomerisierung des Proteins, durch die instabile Stränge von der Umgebung abgeschirmt werden können, war im mutierten Tom40 reduziert. Die verbesserte Stabilität des mutierten Proteins stellt eine Grundlage für die kristallographische Strukturbestimmung von Tom40 dar.