Nutzung von Glycerin und Rohglycerin als C-Quelle für die Produktion von L-Phenylalanin mit rekombinanten Escherichia coli-Stämmen

Abstract

Glycerin ist ein nachwachsender Rohstoff, der als C-Quelle von Mikroorganismen wie z. B. Escherichia coli (E. coli) für die Produktion von Fein- und Massenchemikalien genutzt werden kann. In E. coli wird Glycerin durch Diffusion oder erleichterte Diffusion über den Glycerinfacilitator GlpF aufgenommen. Unter aeroben Bedingungen wird Glycerin über die ATP-abhängige Glycerinkinase GlpK zu Glycerin-3-Phosphat (G3P) phosphoryliert. Anschließend wird G3P über die G3P-Dehydrogenase GlpD zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) oxidiert und geht dann in den Zentralstoffwechsel ein. Die üblicherweise für die mikrobielle Produktion von Fein -und Massenchemikalien eingesetzte C-Quelle Glucose wird PEP-abhängig in die Zelle aufgenommen. Bis zum Erreichen des DHAP werden hier keine Reduktionsäquivalente gebildet, weshalb insgesamt weniger ATP über die Atmungskette regeneriert werden kann. Somit können reduzierte Metabolite, oder Substanzen, die mit hohem ATP-Aufwand synthetisiert werden, mit Glycerin in höheren Ausbeuten gebildet werden. Daher erscheint die Verwendung von Glycerin für die Biosynthese von aromatischen Aminosäuren als sinnvoll. Die Verwendung von Glycerin hat aber auch Nachteile, wie das langsamere Zellwachstum. Zurückzuführen ist dies vermutlich auf Limitierungen im Stoffwechsel durch GlpK oder der Reaktion von Fructose-1,6-Bisphosphat (Fru-1,6-BP) zu Fructose-6-Phosphat (F6P). In der vorliegenden Arbeit wurde daher am Beispiel der L-Phenylalaninproduktion untersucht, wie mögliche Limitierungen durch metabolic engineering oder verbesserter Fermentationsführung umgangen werden können. Auch der direkte Einsatz von Rohglycerin wurde untersucht. Weiterhin war gezeigt worden, dass die Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-Phosphat (E4P) limitierend für die Produktion aromatischer Stoffe sind. Dies war durch die Überexpression von tktA, dem Gen für die Transketolase oder der Inaktivierung von pykA oder pykF, den Genen für die Pyruvatkinasen A und F behoben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb untersucht, ob diese Limitationen auch bei Glycerin als C-Quelle auftreten. Als Modellorganismus wurde der E. coli-Stamm FUS4/pF81 verwendet. Es wurde gezeigt, dass das Wachstum von FUS4/pF81 mit Glucose (Glu), Glycerin (Gly) oder Rohglycerin (RG) deutlich schneller war (Glu µ = 0,49 ± 0,1 h-1; Gly µ = 0,26 ± 0,1 h-1; RG µ = 0,32 ± 0,1 h-1) die C- und die Raum-Zeit-Ausbeuten von Glycerin und Rohglycerin aber deutlich höher waren (Glu: 18,8 ± 2,0 %, 0,13 ± 0,1 g/l/h; Gly: 26,3 ± 0,3 %, 0,26 ± 0,1 g/l/h; RG: 23,2 ± 4,5 %, 0,22 ± 0,05 g/l/h). Es wurde auch gezeigt, dass das Absenken der O2-Verfügbarkeit vorteilhaft ist. Bei 60% O2-Sättigung wurde eine C-Ausbeute von 18,3 ± 2,5 % und eine Raum-Zeit-Ausbeute von 0,21±0,02 g/l/h erreicht. Bei 20% O2-Sättigung wurden dagegen 26,3 ± 0,3 % und 0,26 ± 0,1 g/l/h erhalten. Die Beobachtung, dass durch höhere O2-Verfügbarkeit der Glycerinverbrauch erhöht (60% O2: 124,7±10,8g; 20% O2: 99,4±4,3g), die Produktbildung aber verringert wurde (Endkonzentration L-Phenylalanin: 60% O2: 7,9±0,2g; 20% O2: 9,4±0,7g), zeigt, dass die Aktivität von GlpK nicht limitierend ist. Untersuchungen an ΔpykA- oder ΔpykF-Stämmen zeigte, dass die Deletion des Gens pykA deutlichere Effekte auf die L-Phenylalaninproduktion ausübte, als die von pykF. Mit dem ΔpykA-Stamm war der Glycerinverbrauch von 124,7±10,8g auf 68,9±10,3g verringert und gleichzeitig die gebildete Menge an L-Phenylalanin gesteigert (von 7,9±0,2 g/l auf 9,5±0,8 g/l). Es wurde eine Steigerung der C-Ausbeute von 18,1±2,3 % auf 33,3±2,7 % erreicht. Die Reaktion von Fru-1,6-BP zu F6P und die E4P-Bereitstellung sind eng verknüpft, da TktA nicht nur über den oxidativen Pentosephosphatweg E4P erzeugt, sondern auch F6P und Glycerinaldehyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und E4P umsetzen kann. Daher wurde dies gemeinsam untersucht. Es zeigte sich, dass die Überexpression von glpX, dem Gen der Fru-1,6-BPase II, oder tktA alleine keine deutliche Verbesserung brachte, die gemeinsame Überexpression aber zu einer Steigerung in der Raum-Zeit-Ausbeute von 0,21±0,01 g/l/h auf 0,40±0,02 g/l/h führte. Durch Kombination der pykA-Deletion mit der Überexpression von glpX und tktA konnte aber die hohe Raum-Zeit-Ausbeute des einen Stammes nicht mit der hohen C-Ausbeute des anderen Stammes vereint werden. Nach der Deletion der Gene beider Pyruvatkinasen wurde dem Stamm für das Wachstum zusätzlich Lactat gefüttert, um den TCA-Zyklus zu erreichen. In der Produktionsphase nur auf Glycerin wurde dann kurzzeitig eine sehr hohe Produktivität mit 90% C-Ausbeute und 0,63±0,03 g/l/h Raum-Zeit-Ausbeute erreicht. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Verwendung von Glycerin oder Rohglycerin anstelle von Glucose für die L-Phenylalaninproduktion nicht nur möglich, sondern auch vorteilhaft ist, da mit dieser C-Quelle hohe C- und Raum-Zeit-Ausbeuten möglich sind.

Glycerol is a renewable resource and can be used as carbon- and energy-source by microorganisms like E. coli. Under aerobic conditions the dissimilation of glycerol in E. coli proceeds via uptake through diffusion or facilitated diffusion (GlpF) and activation by an ATP-dependent glycerol kinase (GlpK) to glycerol-3-phosphate (G3P). G3P is then oxidized by G3P dehydrogenase (GlpD) to dihydroxyacetone phosphate (DHAP), which enters the central carbon metabolism. Currently, glucose is the carbon- and energy-source of choice for the microbial production of fine chemicals. Glucose enters the cell in a PEP-dependent manner. During its metabolism no reducing equivalents are produced until DHAP is reached and so less ATP can be produced via the respiratory chain in comparison to glycerol. For this reason, reduced compounds or chemicals which afford high ATP-input, can be produced at higher yields with glycerol as carbon source. Because of these advantages, the utilization of glycerol seems to be favourable for the biosynthesis of fine chemicals like aromatic amino acids, which are produced by the cell at high energy expenditure. The utilization of glycerol, however leads to slower cell growth, which can lead to a lower space-time-yield. This is probably due to limitations in the metabolism like the reaction catalyzed by GlpK or the reaction from fructose-1,6-bisphosphate (Fru-1,6-BP) to fructose-6-phosphate (F6P). In the current work, it was investigated, at the example of L-phenylalanine production, how these limitations can be overcome by metabolic engineering or by an improved fermentation procedure. Also the usage of crude glycerol as carbon source was investigated. The supply of phosphoenolpyruvate (PEP) and erythrose-4-phosphate (E4P) has been shown as limiting steps for the production of aromatics. This can be overcome by the overexpression of tktA, the gene for the transketolase A, or the inactivation of pykA or pykF, the genes for the pyruvate kinases A and F. So it was investigated, if these limitations also occur with glycerol. As model organism the E. coli strain FUS4/pF81 was utilized. Through fermentation of FUS4/pF81 with glucose, glycerol, or crude glycerol cell growth was much faster on glucose (glucose µ = 0.49 ± 0.1 h-1; glycerol µ = 0.26 ± 0.1 h-1; crude glycerol µ = 0.32 ± 0.1 h-1) but the yield (gram C substrate/ gram C product [%]; space-time-yield [g/h/l]) was significantly higher with glycerol and crude glycerol (glucose: 18.8 ± 2.0%, 0.13 ± 0.1 g/l/h; glycerol: 26.3 ± 0.3 %, 0.26 ± 0.1 g/l/h; crude glycerol: 23.2 ± 4.5 %, 0.22 ± 0.05 g/l/h). During the growth on glycerol the utilization of low oxygen concentrations was beneficial. With 60% oxygen saturation yields of 18.3 ± 2.5 % and 0.21±0.02 g/l/h were reached. In contrast, with 20% oxygen saturation values of 26.3 ± 0.3 % and 0.26 ± 0.1 g/l/h were obtained. Concomitantly with the increase of the oxygen availability the glycerol consumption increased (60% O2: 124.7±10.8g; 20% O2: 99.4±4.3g), but the production rate decreased (end concentration L-phenylalanine: 60% O2: 7.9±0.2g; 20% O2: 9.4±0.7g). It was therefore assumed that GlpK is not limiting. The investigation of the two pyruvate kinases showed, that the deletion of pykA was more beneficial than the knockout of pykF. With the ΔpykA-strain the glycerol consumption decreased from 124.7±10.8g to 68.9±10.3g and concomitantly the production rate increased (from end concentration L-phenylalanine 7.9±0.2 g/l to 9.5±0.8 g/l). So an increase in the carbon yield from 18.1±2.3 % to 33.3±2.7 % was reached. The reaction from Fru-1,6-BP to F6P and the supply of E4P are closely related, since TktA not only provides E4P via the oxidative pentose phosphate pathway but also converts F6P and glyceraldehyde-3-phosphate to xylulose-5-phosphate und E4P. Therefore these two points were investigated together. It was shown that the overexpression of glpX, the gene for the Fru-1.6-BPase II or tktA alone had no significant effects whereas the combination of both modifications led to an increase in space-time-yield from 0.21±0.01 g/l/h to 0.40±0.02 g/l/h. However, the combination of the pykA-deletion with the overexpression of glpX and tktA did not lead to a merging of the high space-time-yield from the one strain with the high carbon recovery of the other strain. After the deletion of both pyruvate kinase genes the strain was fed with additional lactate to fill the TCA-cycle. In the production phase, glycerol was fed as the sole carbon and energy-source. In this phase a short-time productivity of 90% carbon recovery and a space-time yield of 0.63±0.03 g/l/h was reached. In summary it could be shown, that for the production of L-phenylalanine the utilization of glycerol or crude glycerol instead of glucose is not only possible but beneficial, since higher yields can be obtained with this carbon source.