Development of a stochastic multi-scale simulation method for the analysis of spatiotemporal dynamics in cellular transport and signaling processes

Abstract

This work focuses on the development of a stochastic simulation. It employs particle tracking methods to elucidate the transport of signaling molecules through the cell. Furthermore the method is extended and applied to analyze vesicle transport between the cellular compartments, especially focusing on the receptor mediated endocytosis which couples signal transduction and membrane trafficking. The simulation is based on Brownian Dynamics, which has the advantage that the solvent - myriads of water molecules in the cell - does not have to be included. Only the molecules of interest diffuse through the virtual cell by performing a random walk in this Monte Carlo method. The cytoskeleton structure and crowding elements are included as stationary obstacles in order to model the structured intracellular conditions. The simulation is able to reproduce the reduced effective diffusion of the in vivo system through these structures. The correct, yet computationally efficient modeling of the (diffusion-limited) reactions in the cell requires an advanced simulation framework. Due to molecular crowding not only the mobility but also the reaction rates are considerably changed under the in vivo conditions. The present work quantifies three factors which determine the effective reaction rate, namely (i) the effect of the excluded volume, (ii) the effect of the reduced mobility, and (iii) the effect of the altered accessibility of the molecules. Ideally the simulation returns the effective in vivo reaction rate if the correct intracellular conditions and the in vitro rate are set as input parameters. Since the different parameters can be easily changed and controlled in the simulation, it can help to understand and bridge the gap between in vivo and in vitro kinetics. The simple and modular principle of the simulation also provides a versatile tool for the analysis of further intra- and extracellular reaction-diffusion processes. The present simulation was applied to signal transduction in the Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathway. Receptors in the plasma membrane of the cell are activated by a ligand, e.g. growth factors. This signal is then transferred to the mobile MAPK molecule via a cascade of molecules. The active (phosphorylated) form of MAPK can then trigger the genes regulating e.g. the growth of the cell. But on the way from the plasma membrane to the nucleus a fraction of the signal is lost due to dephosphorylation reactions - in the extreme case no active MAPK molecule reaches the nucleus. The simulation was used to analyze this signal transduction process covering both the spatial and the stochastic properties. The results show, that the structure and the parameters of the model determine the outcome of the signaling system. The model was also extended to include transport by motor proteins along the cytoskeleton, which can increase the signal strength in the nucleus as predicted by Kholodenko. The stochastic and spatial aspects are of an even greater importance in the field of vesicle transport. The low number of vesicles in a cell leads to high stochastic fluctuations. Furthermore the vesicles have to be guided to their target compartment through the crowded intracellular space. The simulation shows that this requires a specialized transport system in which the membrane trafficking network is aligned with the cytoskeleton structures in the cell. The constraints which limit the functionality of the model lead to valuable insights into the system. The present model also includes the molecular machinery that governs the formation, transport, and targeting of the vesicles - namely coat molecules (COPI, COPII, clathrin), SNAREs (Soluble NSF Attachment Protein REceptors), and motor proteins (Dynein, Kinesin, Myosin). This enables investigating the maintenance of the vesicle machinery, their recycling, and especially the on demand regulation of vesicle formation based on cargo load -- for example in receptor mediated endocytosis. The latter effect leads to a reduction of active receptors in the plasma membrane, thus reducing the signal strength in signal transduction. The simulation is able to couple vesicle transport and signal transduction models in order to investigate this effect. Eventually also the polarization of the cell depends on the targeted vesicle transport. Special proteins adjust the structure of the cytoskeleton based on the information of activated signaling molecules.

In dieser Arbeit wurde eine stochastische Simulationsmethode entwickelt, welche den Transport von Signalmolekülen durch die Zelle im Modell abbildet. Die Agenten-basierte Methode ermöglicht mit einer entsprechenden Erweiterung zudem die Analyse des Vesikeltransports zwischen den einzelnen membranumschlossenen Kompartimenten der Zelle. Dabei wird auch die Kopplung des Vesikeltransports und der Signaltransduktion berücksichtigt, welche durch den Endozytose-Prozess der Rezeptoren ausgelöst wird. Die Simulation basiert auf der Modellierung der Brownschen Dynamik, bei der die Moleküle des Lösungsmittels (hier Milliarden von Wassermolekülen) nicht explizit berücksichtigt werden müssen. Nur die Moleküle von Bedeutung werden im Modell abgebildet und vollführen eine Zufallsbewegung in der Monte-Carlo Simulation. Die dichten Strukturen und Hindernisse des intrazellulären Mediums können in der Simulation ebenfalls dargestellt werden und führen zu einer reduzierten effektiven Diffusionsrate durch die virtuelle Zelle, welche den realen Gegebenheiten in der Zelle entspricht. In der Simulation wurde insbesondere darauf geachtet, dass die (diffusions-limitierten) Reaktionsprozesse in der Zelle richtig abgebildet und effizient modelliert werden. Aufgrund des 'molecular crowding' - der dicht gedrängten Zustände durch die vielen Makro-Moleküle in der Zelle - ändern sich die Reaktionsraten im Vergleich zu verdünnten in vitro Bedingungen, bei denen einzelne Reaktionen isoliert untersucht werden. Die Simulation spiegelt diese Effekte wider. Darüber hinaus können die einzelnen Parameter des Modells einfach angepasst werden, so dass die Effekte einzeln untersucht und mit ihren Ursachen verknüpft werden können. Dieses detailierte Verständnis erlaubt es, die Lücke zwischen der in vivo und der in vitro Kinetik zu überbrücken. Die Simulation wurde verwendet, um die Signalübertragung durch ein MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) System zu modellieren. Darin werden Rezeptoren in der Plasmamembran der Zelle durch einen Liganden (z.B. Wachstumsfaktoren) aktiviert. Dieses Signal wird dann über eine Kaskade von Zwischenmolekülen auf die mobilen MAPK-Proteine übertragen. Die aktive (phosphorylierte) Form MAPKp kann dann die entsprechenden Gene im Zellkern regulieren, welche z.B. das Wachstum steuern. Auf dem Weg von der Plasmamembran zum Zellkern geht jedoch ein gewisser Teil des Signals verloren, da Phosphatasen die MAPKp-Moleküle dephosporylieren. Im Extremfall kann das Signal den Kern gar nicht erreichen. Die Simulation wurde verwendet um diesen Signalweg zu analysieren, wobei sowohl die räumlichen als auch die stochastischen Eigenschaften berücksichtigt wurden. Darüber hinaus wurde auch der Transport der MAPKp durch Motor-Proteine entlang des Zytoskeletts zum Zellkern modelliert, was die Stärke des Signals am Kern positiv beeinflussen kann. Die stochastischen und räumlichen Eigenschaften sind auf dem Feld des Vesikel-Transports von noch größerer Bedeutung. Die niedrige Zahl der Vesikel in der Zelle führt zu stärkeren stochastischen Fluktuationen. Außerdem müssen die Vesikel gezielt zu ihren Zielkompartimenten geführt werden. Das in der Simulation dargestellte Modell vereint das heutige Wissen über den Vesikeltransport. Es zeigt, dass die Vesikel ein spezielles Transportsystem benötigen, in dem die membranumhüllten Strukturen eng mit der Zytoskelettstruktur verbunden sein müssen. Die Grenzen der Funktionalität des Modells geben zudem wertvolle Hinweise auf die tatsächliche Organisation des Systems. Das hier vorgestellte Modell für die Bildung, den Transport und die Navigation bzw. Adressierung der Vesikel basiert auf molekularen Interaktionen. Dabei handelt es sich um Coat-Moleküle (COPI, COPII, clathrin), SNAREs (Soluble NSF Attachment Protein REceptors) und Motor-Proteine (Dynein, Kinesin, Myosin). In diesem detailierten Modell kann die Aufrechterhaltung der Transport-Maschinerie, das Recycling der einzelnen Komponenten sowie die bedarfsgerechte Steuerung des Vesikel-Transports untersucht werden. Dies beinhaltet auch die Rezeptor-vermittelte Endozytose. Die Untersuchung zeigt darüber hinaus, dass die Zell-Polarität durch den gerichteten Vesikeltransport beeinflusst werden kann. Die dafür erforderliche spezialisierte Zytoskelettstruktur wird im Gegenzug auch durch die Information von aktiven Signalmolekülen kontrolliert.