Reaktion Tumor-assoziierter Fibroblasten aus Lungenkarzinomen auf Kinase-Inhibitoren und Chemotherapeutika in verschiedenen Kulturmodellen

Abstract

Tumor-assoziierte Fibroblasten (TAF) werden in zunehmendem Maß als bedeutender Zelltyp in soliden Tumoren erkannt. Der wechselseitige Einfluss von TAF und Tumorzellen entscheidet mit über das Therapieansprechen von Karzinomen. In dieser Arbeit sollte daher geklärt werden, wie die TAF aus Lungentumoren auf herkömmliche Chemotherapie (Cisplatin) reagieren und ob sie mit einer Behandlung gezielt so verändert werden können, dass sie ihren Tumor-unterstützenden Phänotyp verlieren. Um effektive Substanzen zur pharmakologischen Modulation des TAF-Phänotyps zu identifizieren, wurde die Wirkung von 151 Kinase-Inhibitoren auf TAF untersucht und gezeigt, dass die Viabilität von TAF vor allem durch PDGFR-Inhibitoren gehemmt werden kann. Dasatinib wurde als effizientester bereits zugelassener Inhibitor identifiziert. Microarray-Analysen der Genexpressionsänderungen von neun TAF bei einer Behandlung mit 0,1 µM Dasatinib identifizierten eine 492 Gene umfassende „Dasatinib Response Signatur“. Funktionelle Experimente mit konditioniertem Medium bestätigten die Reduktion der Tumor-fördernden Eigenschaften primärer TAF auf die H1299-Lungentumor-Zelllinie nach einer Dasatinib-Behandlung der TAF. Zusätzlich wurde in der Gewebeschnitt-Kultur mit frischem Tumoren gezeigt, dass Dasatinib in individuellen Tumoren die Proliferation von Tumorzellen hemmen und den Zelltod von TAF und Tumorzellen induzieren kann. Bei einer Dasatinib-Behandlung wird der Phänotyp der TAF demnach so moduliert, dass deren Tumor-fördernde Eigenschaften verringert werden können. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die variable Reaktion von TAF auf Cisplatin näher untersucht. Als Ursachen dafür wurden Patientencharakteristika wie Alter und Geschlecht sowie die Tumorhistologie ausgeschlossen, ebenso wie tp53-Mutationen und der SNP rs1042522. Dagegen wurden in Kokultur-Experimenten mit TAF und H1299-Lungentumorzellen Hinweise gefunden, dass die wechselseitige Beeinflussung der Zelltypen die Cisplatin-Sensitivität moduliert und die Heterogenität der TAF verringert. TAF sind in Kokultur resistenter gegen Cisplatin und reagieren homogener als in Monokultur, H1299 sind sensitiver. Auch im Gewebekulturmodell konnte gezeigt werden, dass die Tumorzellen die Reaktion der TAF auf Cisplatin beeinflussen können. Unabhängig von tp53-Mutationen der Tumore wurde eine p53-Stabilisierung in TAF humaner Lungentumore nur dann nachgewiesen, wenn die Tumorzellen selbst mit einer p53-Stabilisierung auf die Cisplatin-Behandlung reagierten. Im Gewebe ist auch der Cisplatin-induzierte Zelltod von Tumorzellen und TAF linear korreliert. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass die Reaktion der TAF auf Chemotherapie durch Tumorzellen beeinflusst werden kann. Im Folgenden wurde untersucht, welchen Einfluss die Dasatinib-induzierte Verminderung des TAF-Phänotyps auf die Cisplatin-Sensitivität von TAF und Tumorzellen hat. TAF zeigten bei einer solchen Kombinations-Behandlung eine reduzierte Sensitivität gegenüber Cisplatin. Im Kokultur-Experiment wurden hingegen keine Unterschiede zu einer alleinigen Behandlung der TAF oder H1299-Zelllinie mit Cisplatin identifiziert. Interessanterweise war die Reaktion der Tumorzellen und TAF in humanem Tumorgewebe individuell sehr unterschiedlich. So gab es sowohl Tumore, bei denen TAF und Tumorzellen auf die Cisplatin-Dasatinib-Kombinations-Behandlung im Vergleich zur Cisplatin-Mono-Behandlung in erheblichem Maß mit Zelltod reagierten, als auch solche, bei denen beide Zelltypen deutlich weniger Zelltod zeigten. Dasatinib steigert somit wahrscheinlich nur in einem Teil der primären Tumore die Wirkung von Chemotherapie. Um Zielstrukturen für wirksame Medikament-Kombinationen zu identifizieren, wurden Unterschiede zwischen TAF und Normalgewebe-assoziierten Fibroblasten (NAF) untersucht. Auf funktioneller und molekularer Ebene wurden aber nur sehr geringe konstitutive Unterschiede festgestellt. Ein Screen mit 1120 zugelassenen Medikamenten konnte keine Substanz identifizieren, die selektiv die Viabilität von TAF hemmt. Auf Chemotherapie mit Cisplatin reagierten NAF schneller als TAF mit Zellzyklus-Arrest. Außerdem wurde die Cisplatin-induzierte HIPK2-Expression von TAF und NAF durch H1299-konditioniertes Medium unterschiedlich beeinflusst. Bei einer kombinierten Behandlung mit zugelassenen PDGFR-Inhibitoren und Cisplatin wurden Hinweise auf unterschiedliche Sensitivitäts-Spektren von TAF und NAF identifiziert. Zusammenfassend stellt die vorliegende Arbeit erstmals eine umfassende Untersuchung der Reaktion von TAF auf Kinase-Inhibitoren und Cisplatin dar. In drei Modellsystemen wurde der Einfluss von TAF und Tumorzellen aufeinander gezeigt und die Verringerung der Tumor-fördernden Eigenschaften der TAF mittels Dasatinib-Behandlung erreicht. Somit ist es nun möglich, das Netzwerk der Abhängigkeiten von TAF und Tumorzellen zu beeinflussen. So könnten Tumore gezielt geschwächt und für andere Therapien sensitiviert werden.

The impact of Cancer-associated Fibroblasts (CAFs) as a prominent cell type in tumours is increasingly appreciated. A reciprocal influence between CAFs and cancer cells may also determine the response to therapy. The goal of the the present study was to determine the response of CAFs from lung tumours to conventional chemotherapy (Cisplatin) and to investigate the possibility to modulate their phenotype in a way that they lose their tumour-supporting function. To identify compounds inhibiting the CAF phenotype the effect of 151 kinase inhibitors was screened. The inhibition of PDGFR was most effective in reducing CAFs’ proliferation. Out of a panel of approved PDGFR inhibitors Dasatinib showed best efficacy. Use of gene expression data comparing CAFs from nine patients treated with Dasatinib or left untreated as a control yielded the so called „Dasatinib Response Signature“ comprising 492 genes whose expression changed upon treatment with 0,1 µM Dasatinib. An overlap with a signature derived from a comparison of CAFs and normal-associated fibroblasts (NAFs), established a group of genes that predicted an improved survival of patients if their expression pattern was similar to CAFs treated with Dasatinib. More importantly, using conditioned medium from CAFs treated with Dasatinib reduced the growth promoting effect on H1299 lung cancer cell line cells as compared to treatment with conditioned medium from CAFs plus Dasatinib. In tissue slice culture of treated versus untreated fresh tumour tissue Dasatinib inhibited proliferation of cancer cells and induced cell death in some of the tumours. These data show that Dasatinib is a new means of inhibiting CAFs’ phenotype in a way that the promotion of tumour growth is reduced. In the second part of this work, the variable effect of Cisplatin treatment on CAFs was analyzed. The current work excluded patient characteristics like age and sex as well as tumour histology as possible causes. In addition, there were no tp53 mutations detected in CAFs from lung tumours and the tp53 SNP rs1042522 had no influence on CAFs’ response to Cisplatin. Interestingly, co-culture with H1299 lung cancer cell line reduced this heterogeneity of CAFs, indicating an influence of cancer cells on CAFs. Furthermore, both cell types affected the sensitivity of the other cell type to Cisplatin. CAFs became more resistant in co-culture, while H1299 cells got more sensitive. Also in the tissue slice culture model there was an influence of cancer cells on CAFs. A Cisplatin-induced p53 stabilisation of CAFs could only be detected if the neighbouring cancer cells were also able to respond to Cisplatin treatment with a stabilisation of p53. This effect was independent of tp53 mutations in these primary lung tumours. Furthermore, cell death induced through Cisplatin treatment in CAFs and cancer cells showed a linear correlation in primary tumour tissue. Therefore, it could be shown that cancer cells influence CAFs’ response to Cisplatin. By treating CAFs with Dasatinib an thereby reducing their tumour promoting activities, one could possibly sensitize tumours to Cisplatin treatment.In mono-culture CAFs showed reduced sensitivity to Cisplatin when Dasatinb was added. In contrast, in co-culture there were no differences between Cisplatin alone or combined with Dasatinib regarding Cisplatin sensitivity of CAFs and H1299 cells. Interestingly, in the tissue slice culture model there were marked differences in the response of CAFs and cancer cells from individual patients. Probably the combination of Dasatinib with Cisplatin does only show preferable results in a subset of tumours. If there were differences between CAFs and NAFs it would be worth considering them a clue to new treatments. There were only minor constitutive differences between CAFs and NAFs regarding all investigated molecular and functional levels. There was no drug in a library with 1120 approved substances that could selectively inhibit CAF’s viability while sparing NAF’s viability. Cell cycle arrest induced by treatment with Cisplatin was faster in NAFs than in CAFs. Furthermore, the induction of HIPK2 expression by treatment with Cisplatin was differentially influenced by conditioned medium from H1299 cells in CAFs versus NAFs. In addition, CAFs and NAFs responded to cotreament with Cisplatin and PDGFR inhibitors in a way that CAFs were less sensitive to Cisplatin when co-treated with Dasatinib or Imatinib, while NAFs showed enhanced sensitivity upon addtion of Nilotinib. In summary, the current work is the first one to comprehensively analyze the response of CAFs to treatment with kinase inhibitors and Cisplatin. A mutual interaction between CAFs and cancer cells could be identified in three model systems. Importantly, a reduction of the tumour growth promoting phenotype of CAFs could be achieved by treatment with Dasatinib.