Please use this identifier to cite or link to this item:
Authors: Morabbi Heravi, Kambiz
Title: Regulation of the mannitol utilization genes in Bacillus subtilis
Other Titles: Regulation der Mannitol-Abbaugene in Bacillus subtilis
Issue Date: 2013 Dissertation
Abstract: Bacillus subtilis takes up mannitol by a phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS). The mannitol utilization system is encoded by the mtlAFD operon consisting of mtlA (encoding membrane-bound EIICBMtl), mtlF (encoding phosphocarrier EIIAMtl), and mtlD (encoding mannitol 1-phosphate dehydrogenase). This operon is activated by MtlR whose coding gene is located approx. 14.4 kb downstream of the operon. The regulation of the mannitol utilization genes in B. subtilis was studied by fusion of the promoters of mtlAFD (PmtlA) and mtlR (PmtlR) to lacZ as a reporter gene. Both the PmtlA and PmtlR were inducible by mannitol and glucitol, while glucose reduced their activities. The promoter strength of PmtlA was about 4.5-fold higher than that of PmtlR. Identification of the transcription start sites of PmtlA and PmtlR revealed that both of these promoters contain a sigma A-type promoter structure. The promoter -35 and -10 boxes in PmtlA were TTGTAT and TAACAT and in PmtlR TTGATT and TATATT, respectively. Catabolite responsive elements (cre) were detected in the sequences of PmtlA and PmtlR overlapping the -10 boxes. Shortening the mRNA 5’untranslated region (5’UTR) increased the PmtlA activity, whereas PmtlR activity was decreased by shortening of its mRNA 5’UTR. Alignment of the -35 upstream sequences of PmtlA and PmtlR revealed the putative MtlR binding site. This sequence comprised a similar incomplete inverted repeat in both the PmtlA and PmtlR sequences (TTGNCACAN4TGTGNCAA). This sequence was encompassed by two 11 bp distal and proximal flanking sequences. Construction of PmtlA-PlicB hybrid promoters and shortening of the 5’-end of PmtlA indicated the probable boundaries of putative MtlR binding site in PmtlA. Increasing the distance between the putative MtlR binding site and -35 box lowered the PmtlA maximal activity, although PmtlA remained inducible by mannitol. PmtlA became inactive by disruption of the TTGNCACAN4TGTGNCAA sequence. In contrast, manipulation of the distal and proximal flanking sequences only reduced the maximal activity of PmtlA, whereas PmtlA remained highly inducible. These flanking sequences contained AT-rich repeats similar to the consensus sequence of alpha CTD binding sites. Regulation of PmtlA and PmtlR was investigated by deletion of mtlAF, mtlF, mtlD, and mtlR. Deletion of the mtlAF genes rendered PmtlA and PmtlR constitutive showing the inhibitory effect of EIICBMtl and EIIAMtl (PTS transporter components) on MtlR in the absence of mannitol. The constitutive activity of PmtlA was increased by the deletion of mtlF. In contrast, the deletion of mtlAFD showed a significant reduction in the PmtlA constitutive activity. Disruption of mtlD made B. subtilis sensitive to mannitol in a way that addition of mannitol or glucitol to the bacterial culture ended in cell lysis. Besides, PmtlA and PmtlR were similarly induced by glucitol and mannitol in a mtlD::erm mutant. Also, deletion of mtlR rendered PmtlA and PmtlR uninducible by mannitol or glucitol. In contrast, deletion of the glucitol utilization genes had no influence on the inducibility of PmtlA or PmtlR by glucitol. The PmtlA activity was drastically reduced in ptsH-H15A (HPr-H15A) mutant similar to the delta mtlR mutant. The mutation of histidine 289 in the PRDI domain of MtlR to alanine reduced the activity of PmtlA, whereas the PmtlA activity in the mtlR H230A mutant was almost similar to wild type. In contrast, mutation of the PRDII domain of MtlR to H342D mainly relieved PmtlA from glucose repression. Moreover, MtlR double mutant H342D C419A which was produced in E. coli was shown to be active in vitro. These results represent the positive regulation of MtlR via phosphorylation of the PRDII domain by HPr(H15~P). Also, dephosphorylation of the domains EIIBGat- and EIIAMtl-like of MtlR by EIIAMtl and EIICBMtl transporter components causes activation. The PmtlA activity was repressed in the presence of glucose and fructose, while sucrose and mannose had no influence on the PmtlA activity. Therefore, catabolite repression of PmtlA and PmtlR were studied by CcpA-dependent carbon catabolite repression mutants, such as ptsH-S46A, delta crh, delta hprK, and delta ccpA. Induction of PmtlA and PmtlR in these mutants did not result in a complete loss of catabolite repression. Therefore, the catabolite responsive elements (cre sites) of PmtlA and PmtlR were investigated. Using a constitutive promoter, PgroE, it was shown that the cre sites of PmtlA and PmtlR were weakly functional. In contrast, deletion of the glucose PTS transporter, encoded by ptsG, resulted in a complete loss of glucose repression in PmtlA and PmtlR. Thus, the main glucose repression of mannitol PTS function at the posttranslational level in a HPr-mediated manner via MtlR-H342 and at transcriptional level by CcpA-dependent carbon catabolite repression.
Bacillus subtilis nimmt Mannitol mit Hilfe eines Phosphoenolpyruvat-abhängigem Phosphotransferasesystems auf. Dieses wird durch das mtlAFD-Operon codiert, welches aus mtlA (codiert das Membran-gebundene EIICBMtl), mtlF (codiert das Phosphorylgruppen-übertragende EIIAMtl) und mtlD (codiert die Mannitol-1-phosphat-Dehydrogenase) besteht. Das Operon wird durch MtlR aktiviert, dessen Gen ca. 14,4 kb stromabwärts des Operons lokalisiert ist. Die Regulation der Gene für die Mannitol-Verwertung in B. subtilis wurde mit Hilfe des Reportergens lacZ untersucht, welches an die Promotoren vom mtlAFD (PmtlA) sowie mtlR (PmtlR) fusioniert wurde. Sowohl PmtlA als auch PmtlR wurden durch Mannitol und Glucitol induziert, während Glucose die Promotoraktivitäten reprimierte. Im Vergleich zu PmtlR zeigte PmtlA eine ca. 4,5-fach höhere Promotorstärke. Die Analyse der Transkriptionsinitiations-Sequenzen durch Transkriptionsstartbestimmung von PmtlA und PmtlR ergab, dass es sich um Sigma A-abhängige Promotoren handelt. Die -35 und -10 Promotorsequenzen von PmtlA und PmtlR wurden als TTGTAT und TAACAT bzw. TTGATT und TATATT identifiziert. In beiden Promotoren wurden cre- Sequenzen (catabolite responsive element) gefunden, welche mit den -10 Regionen überlappen. Eine Verkürzung der 5‘-untranslatierten Region (5’UTR) von PmtlA erhöhte dessen Aktivität, wohingegen die Aktivität von PmtlR durch die Verkürzung der 5’UTR reduziert wurde. Durch Sequenzalignment der stromaufwärts von PmtlA und PmtlR gelegenen Sequenzen konnte die mutmaßliche MtlR-Bindestelle identifiziert werden. Diese Bindestelle ist in beiden Sequenzen durch eine unvollständig ausgeprägte, invertierte Wiederholungssequenz (TTGNCACAN4TGTGNCAA) charakterisiert, welche ihrerseits von jeweils zwei 11 bp langen Sequenzen flankiert wird. Die Regulation von PmtlA und PmtlR wurde mit Hilfe von mtlAF-, mtlF-, mtlD- und mtlR-Deletionen in B. subtilis untersucht. Die Deletion von mtlAF führte zu einer konstitutiven Aktivität von PmtlA und PmtlR, wodurch der inhibitorische Effekt von EIICBMtl und EIIAMtl (Untereinheiten des PTS-Transporters) auf MtlR bei Abwesenheit von Mannitol gezeigt werden konnte. Die konstitutive Aktivität von PmtlA wurde durch die Deletion von mtlF noch verstärkt. Im Gegensatz dazu verursachte die Deletion von mtlAFD eine signifikante Reduktion der konstitutiven Aktivität von PmtlA. Die Mutation von mtlD resultierte in einer Sensitivität von B. subtilis gegenüber Mannitol und Glucitol. Kultivierung in Gegenwart dieser Zucker führte zu einer Lyse der Zellen. In der mtlD::erm Mutante wurden PmtlA und PmtlR durch Glucitol und Mannitol gleichermaßen induziert. Ferner führte die Deletion von mtlR zu einer Uninduzierbarkeit von PmtlA und PmtlR mit Mannitol und Glucitol, wohingegen die Deletion der Gene für die Glucitol-Verwertung keinen Einfluss auf die Induzierbarkeit von PmtlA und PmtlR mit Glucitol hatte. Wie auch in der Delta mtlR Mutante war die Aktivität von PmtlA in der ptsH-H15A (HPr-H15A) Mutante drastisch reduziert. Die Mutation des Histidin 289 in der PRDI-Domäne von MtlR zu einem Alanin reduzierte die Aktivität von PmtlA, während die Aktivität von PmtlA in der mtlR-H230A-Mutante ähnlich wie die des Wildtyps war. Im Gegensatz dazu führte die Mutation H342D der PRDII-Domäne von MtlR zu einer verminderten Glucose-Repression von PmtlA. Eine MtlR Doppelmutante H342D C419A wurde in E. coli produziert und ihre Aktivität in einem Gelmobilityshiftassay in vitro bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass MtlR einer, durch die Phosphorylierung der PRDII-Domäne durch HPr(H15~P) stattfindenden, positiven Regulation unterliegt. Ferner kann eine Aktivierung von MtlR durch eine Dephosphorylierung der EIIBGat- und EIIAMtl-ähnlichen Domänen durch die EIIAMtl und EIICBMtl Transporter-Untereinheiten erreicht werden. Glucose und Fructose reprimieren die Aktivität von PmtlA wohingegen Saccharose und Mannose keinen Einfluss auf die PmtlA-Aktivität haben. Daher wurde die Kohlenstoff-Katabolit-Repression von PmtlA und PmtlR in CcpA-abhängigen Mutanten, wie ptsH-S46A, Delta crh, Delta hprK und Delta ccpA, untersucht. Da eine Induktion von PmtlA und PmtlR in den Mutanten nicht zu einem vollständigen Verlust der Katabolit-Repression führte, wurden die cre-Sequenzen (catabolite responsive element) der beiden Promotoren untersucht. Mit Hilfe des konstitutiven Promotors PgroE wurde gezeigt, dass die cre-Sequenzen von PmtlA und PmtlR nur schwach funktionsfähig waren. Im Gegensatz dazu führte die Deletion des Glucose-PTS-Transporters, welcher von ptsG codiert wird, zu einem vollständigen Verlust der Glucose-Repression von PmtlA und PmtlR. Folglich wird die Repression des Mannitol-PTS durch Glucose hauptsächlich posttranslational durch HPr via MtlR-H342 und auf transkriptionaler Ebene durch eine CcpA-abhängige Kohlenstoff-Katabolit-Repression vermittelt.
Appears in Collections:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Kambiz_Morabbi_Heravi_IIG_Dissertation.pdf5,21 MBAdobe PDFView/Open

Items in OPUS are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.