Isoform specific functions of protein kinase D3 (PKD3) in breast cancer cell proliferation and motility

Abstract

The protein kinase D (PKD) family of serine/threonine kinases belongs to the family of calcium/calmodulin-dependent protein (CAM) kinases and comprises three family members, PKD1, PKD2 and PKD3. By the phosphorylation of numerous protein substrates, PKDs regulate a variety of different cellular functions such as proliferation and differentiation, membrane and vesicle transport, apoptosis, gene expression, adhesion, motility and invasion. Most studies on PKDs have focused on the cellular regulation and functions of PKD1 and PKD2 and in general, the three PKD isoforms are thought to possess overlapping substrate specificities and function, at least in part, redundantly. However, emerging evidence suggests that isoform specific differences exist. Due to its structural characteristics PKD3 appears to play a unique role among the three isoforms, nevertheless it still is the least studied family member. The aim of this study was therefore to reveal isoform specific functions of PKD3 in the context of breast cancer biology. In the first part of this thesis, the regulation of cell adhesion and motility by PKD3-mediated phosphorylation of the G-protein coupled receptor kinase-interacting protein 1 (GIT1) was investigated. The continuous assembly and disassembly of focal adhesions (FA) is required for efficient cell spreading and migration. GIT1 is a multidomain protein whose dynamic localization to sites of cytoskeletal remodeling is critically involved in the regulation of these processes. Mass spectrometry analysis identified a novel phosphorylation site within GIT1 at serine 46, the phosphorylation of which was abrogated by PKD3, but not PKD1 and/or PKD2 depletion, thereby identifying GIT1 as the first PKD3-specific substrate. Functional experiments further provide support that PKD3-mediated GIT1 phosphorylation on serine 46 represents a molecular switch by which GIT1 localization and thus paxillin trafficking, cellular protrusive activity and motility of breast cancer cells are regulated. In the second part of this thesis the consequences of elevated expression of PKD3 in triple-negative breast cancer (TNBC) cells were investigated. Using a phospho-kinase signaling array, PKD3 was identified to trigger the activation of S6 kinase 1 (S6K1), a main downstream target of the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. Accordingly, PKD3 knockdown in TNBC cells led to reduced S6K1 phosphorylation, which was associated with impaired activation of mTOR at lysosomal membranes and the accumulation of the autophagy marker LC3. PKD3 depletion strongly inhibited proliferation of TNBC cells, most likely in part through the suppression of mTOR activation. These findings uncover a novel role for PKD3 in the homeostasis of the endolysosomal system and implicate this kinase as a potential molecular therapeutic target in TNBC. In summary, the experimental studies performed in this thesis provide novel insights into isoform specific functions of PKD3 in the context of breast cancer cell motility and the progression of TNBC.

Die Proteinkinase D (PKD) Familie der Serin/Threoninkinasen gehört zur Familie der Calcium/Calmodulin-abhängigen (CAM) Kinasen und umfasst die drei Mitglieder PKD1, PKD2 und PKD3. Durch die Phosphorylierung zahlreicher Proteinsubstrate regulieren PKDs eine Vielzahl an verschiedenen zellulären Funktionen wie beispielsweise Proliferation und Differenzierung, Membranen- und Vesikeltransport, Apoptose und Genexpression sowie Adhäsion, Motilität und Invasion. Viele Studien über PKD haben sich mit der zellulären Funktion und Regulation der ersten beiden Isoformen, PKD1 und PKD2 beschäftigt und im Allgemeinen geht man davon aus, dass die PKD Isoformen überlappende Substratspezifitäten und zumindest teilweise redundante Funktionen aufweisen. Jedoch deuten neueste Erkenntnisse darauf hin, dass auch Isoform-spezifische Unterschiede existieren. Aufgrund ihrer strukturellen Besonderheiten wird vermutet, dass PKD3 eine gesonderte Funktion innerhalb der Kinasefamilie spielt, dennoch ist PKD3 die bisher am wenigsten untersuchte Isoform. Das Ziel dieser Promotionsarbeit liegt daher auf der Enthüllung PKD3-spezifischer Funktionen im Rahmen der Biologie von Brustkrebs. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die Regulation von Zelladhäsion und Zellmotilität durch PKD3-vermittelte Phosphorylierung des G-protein gekoppelten Rezeptor Kinase Interaktionsproteins 1 (GIT1) untersucht. Der kontinuierliche Aufbau und Abbau von Fokalen Adhäsionen (FA) ist Voraussetzung für eine effiziente Zellausbreitung und Migration. GIT1 ist ein multidomänes Protein, dessen subzelluläre Lokalisation zu Positionen innerhalb der Zelle, an denen das Zytoskelett aktiv umgebaut wird, kritisch mit der Regulation dieser Prozesse verbunden ist. Massenspektrometrische Analysen identifizierten in GIT1 eine neue Phosphorylierungsstelle an Serin 46, deren Phosphorylierung nur durch PKD3, nicht aber PKD1 und /oder PKD2 Verlust aufgehoben werden konnte, wodurch GIT1 als das erste PKD3-spezifische Substrat ermittelt wurde. Weitere funktionelle Experimente zeigen auf, dass die Phosphorylierung von GIT1 an Serin 46 durch PKD3 einen molekularen Schalter darstellt, durch den die Lokalisation von GIT1 und dadurch der Transport von Paxillin sowie die zelluläre Ausbreitung und Motilität von Brustkrebszellen reguliert wird. Im zweiten Teil der Doktorarbeit wurden die Konsequenzen erhöhter PKD3 Expression in dreifach-negativen Brustkrebszellen (TNBC) untersucht. Durch einen phospho-spezifischen Kinasearray wurde herausgefunden, dass PKD3 die Aktivierung der S6 Kinase 1 (S6K1) induzierte, welche ein Hauptsubstrat des mammalian target of rapamycin (mTOR) Signalwegs darstellt. Folglich führte der Knockdown von PKD3 in dreifach-negativen Brustkrebszellen zu einer verminderten Phosphorylierung der S6K1, welche mit einer verschlechterten Aktivierung von mTOR an lysosomalen Membranen und der Akkumulation des Autophagiemarkers LC3 assoziiert war. Der Verlust von PKD3 hemmte deutlich die Proliferation von TNBC Zellen, vermutlich teilweise durch die Unterdrückung der Aktivierung von mTOR. Diese Ergebnisse decken eine neue Rolle von PKD3 in der Homöostase des endolysosomalen Systems auf und weisen darauf hin, dass PKD3 ein molekulares, therapeutisches Ziel in dreifach-negativem Brustkrebs darstellen kann. Zusammengefasst bieten die experimentellen Studien dieser Doktorarbeit neue Einblicke in Isoform-spezifische Funktionen von PKD3 bezüglich der Motilität von Brustkrebszellen und der Tumorprogression von dreifach-negativem Brustkrebs.