Hydrogelsysteme auf Basis UV-polymerisierbarer Biopolymere für den Aufbau von Gewebemimetika mittels Inkjet-Bioprinting am Beispiel von hyalinem Knorpel

Abstract

Gegenstand der Arbeit war die Darstellung von Biopolymer-basierten, gewebeähnlichen Hydrogelsystemen und deren Formulierung als Biotinten für das Inkjet-Bioprinting. Dafür wurden zwei Bestandteile der natürlichen extrazellulären Matrix gewählt: Gelatine und Chondroitinsulfat. Beide wurden durch Reaktion mit Methacrylsäureanhydrid derivatisiert. Zur Anpassung der Geleigenschaften an verschiedene native Gewebe durch Variation des Vernetzungsgrades wurden Gelatinederivate mit verschiedenen Methacrylierungsgraden der Aminogruppen erzeugt: Ca. 70 % bis ca. 100 %. Chondroitinsulfat wurde mit einem Methacrylierungsgrad der Disaccharideinheiten von ca. 23 % derivatisiert. Unter Variation des Methacrylierungsgrades sowie des Massenanteiles konnten durch UVA-initiierte Vernetzung in Anwesenheit des Photoinitiators Irgacure® 2959 chemisch stabile Gelatinehydrogele mit großer Variationsbreite ihrer Quellbarkeit (ca. 370 % bis 965 %) und mechanischen Festigkeit (ca. 5 kPa bis 370 kPa) erzeugt werden. Die erreichten Quellbarkeiten und mechanischen Festigkeiten lagen im Bereich verschiedener nativer Weichgewebe. Die Vernetzung mithilfe eines hoch intensiven, fokussierten Laserstrahles im Sinne der Zweiphotonenpolymerisation ermöglichte außerdem die Erzeugung von mikrostrukturierten Gelatinehydrogelen. Gelenkknorpel (hyaliner Knorpel), welcher in der vorliegenden Arbeit als Modellgewebe gewählt wurde, besitzt herausragende Eigenschaften bezüglich seiner Festigkeit und Quellbarkeit. Durch die Integration von Chondroitinsulfat in die Gelatinehydrogele konnten die Geleigenschaften im Hinblick auf die Beschaffenheit von nativem Gelenkknorpel verbessert werden, indem die Quellbarkeit bei gleichbleibender Festigkeit signifikant erhöht wurde. So wiesen beispielsweise 10 Gew.-%-ige Gelatinehydrogele (Methacrylierungsgrad ca. 85 %) einen Speichermodul von ca. 9,8 kPa und eine Quellbarkeit von ca. 660 % auf. Vergleichbare Hybrid-Hydrogele mit Chondroitinsulfat besaßen mit ca. 10,7 kPa einen nahezu unveränderten Speichermodul, wohingegen die Quellbarkeit mit ca. 830 % signifikant höher war. Die physikalischen Eigenschaften der Hybrid-Hydrogele aus Gelatine und Chondroitinsulfat waren damit nativem Gelenkknorpel ähnlicher als die reiner Gelatinehydrogele. Bei der Verkapselung von Chondrozyten in dreidimensionale Gelatine- und Gelatine-Chondroitinsulfat-Hydrogele zeigte sich ein deutlicher Einfluss der Gelzusammensetzung auf die Morphologie und das Proliferationsverhalten der Zellen. Chondrozyten in Chondroitinsulfat-haltigen Gelen wiesen eine zellarttypische kugelige Morphologie und eine geringe proliferative Aktivität auf. Chondrozyten in reinen Gelatinegelen besaßen vorwiegend eine Fibroblasten-artige Morphologie und eine höhere Proliferationsrate, wie es für dedifferenzierte Chondrozyten typisch ist. Dies deutet darauf hin, dass die dargestellten Chondroitinsulfat-haltigen Hydrogele den Chondrozyten-spezifischen Differenzierungszustand stabilisierten, während reine Gelatinehydrogele dies nicht taten. Im Hinblick auf die Verarbeitung der dargestellten Materialsysteme mittels Inkjet-Druckverfahren wurde die Viskosität der Hydrogelprecursorlösungen untersucht. Lösungen unmodifizierter und niedrig methacrylierter Gelatine mit Massenanteilen >= 10 Gew.-% gelierten bei 25 °C und besaßen selbst bei 37 °C Viskositäten > 10 mPa s, die für kommerzielle Inkjet-Druckköpfe zu hoch sind. Dahingegen wiesen Lösungen hoch methacrylierter Gelatine bei 37 °C und 25 °C bis zu Konzentrationen von 15 Gew.-% Inkjet-druckbare Viskositäten < 10 mPa s auf. Die zusätzliche Acetylierung der Gelatinederivate mit niedrigem Methacrylierungsgrad bewirkte eine Maskierung noch vorhandener freier Aminogruppen, ohne dass sich der Gehalt an vernetzbaren Methacrylgruppen änderte. Durch die daraus resultierende Reduktion der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen der Gelatinemakromonomere konnten auch diese Lösungen zu Inkjet-druckbaren Biotinten formuliert werden. Die Doppelfunktionalisierung mit Acetyl- und Methacrylgruppen ermöglichte damit die Formulierung von Gelatine-basierten Inkjet-Biotinten mit einer großen Bandbreite der Quellbarkeit und der Festigkeit der resultierenden Hydrogele. Die dargestellten Materialsysteme wurden als Biotinten mit einem piezoelektrischen Mikrodosiersystem verarbeitet. Dabei konnte bei einer Drucktemperatur von 25 °C ein stabiler Druckprozess etabliert werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine solche Verarbeitung für Chondrozyten zytokompatibel ist. In der vorliegenden Arbeit gelang damit die Formulierung von Biopolymer-basierten Biotinten für das Inkjet-Bioprinting mit lebenden Säugerzellen. Diese Biotinten können zu Hydrogelen vernetzt werden, deren mechanische Eigenschaften verschiedenen nativen Geweben entsprechen. Die dargestellten Materialsysteme besitzen damit ein hohes Potenzial für den Aufbau funktionaler Gewebemodelle, wie zum Beispiel hyaliner Knorpel, mit biomimetischer Kompartimentierung und Mikrostruktur.

The present study concerns the development of biopolymer-based hydrogel systems with mechanical properties of native tissues and their formulation as bioinks for inkjet bioprinting. Therefore, two biopolymers from the ECM of native tissues served as basis for hydrogel synthesis: gelatin and chondroitin sulfate. Crosslinkable derivatives of these biopolymers were prepared by reaction with methacrylic anhydride. With respect to the adaption of the hydrogels’ properties to different native tissues by variation of the crosslinking density, gelatin derivatives with different degrees of methacrylated amino groups were prepared: Ca. 70 % to nearly 100 %. The degree of methacrylated disaccharide units of chondroitin sulfate was approximately 23 %. Varying the degree of methacrylation and the mass fraction, chemically stable gelatin hydrogels covering a broad range of swellability (ca. 370 % to 965 %) and mechanical strength (ca. 5 kPa to 370 kPa) were prepared by UV-induced crosslinking in the presence of the photoinitiator Irgacure® 2959. Thereby, the established values were in the range of various native tissues. Furthermore, crosslinking by the aid of an especially intensive and focused laser beam (two-photon polymerisation) allowed the generation of microstructured gelatin hydrogels. The ECM of articular cartilage, which was choosen as model tissue, is unique in its mechanical strength and water uptake capability. Integration of chondroitin sulfate into gelatin hydrogels led to a significant increase in the hydrogels’ swellability at remaining mechanical strength. For example, 10 wt% gelatin hydrogels (degree of methacrylation ca. 85 %) possessed a storage modulus of ca. 9.8 kPa and a degree of swelling of about 662 %. Comparable hybrid hydrogels based on gelatin and chondroitin sulfate held an equivalent storage modulus of ca. 10.7 kPa, whereas the swellability by 830 % was significantly higher. Thus, physical properties of hybrid hydrogels prepared from gelatin and chondroitin sulfate were closer to the native cartilage ECM than those of pure gelatin hydrogels. With respect to the generation of cell-laden tissue mimetics, cytocompatibility of crosslinking solutions and crosslinking conditions were tested for cartilage cells (chondrocytes). Cytocompatible limits concerning the photoinitiator Irgacure® 2959 (ca. 2 mg/mL), UVA irradiation time and intensity (ca. 10 min at 8.5 mW/cm2), as well as incubation of the cells in an argon atmosphere (ca. 120 min) were determined. Cell encapsulation experiments applying porcine chondrocytes showed that hydrogel composition had marked impact on cell morphology and proliferation capability. Chondrocytes encapsulated into gelatin-chondroitin sulfate hybrid hydrogels held cell-type specific spherical morphology and low proliferation rate. In contrast, chondrocytes cultured in pure gelatin hydrogels build fibroblastoid, elongated cell morphology and showed higher proliferative activity, which is typical of dedifferentiated chondrocytes. This suggests that hydrogels containing chondroitin sulfate may provide chondrocyte-specific differentiation status, whereas pure gelatin hydrogels may not. With regard to the processing of the developed material systems by inkjet printing technique, the viscosity of several hydrogel precursor solutions was examined. Solutions made from unmodified or slightly methacrylated gelatin with mass fractions &#8805; 10 wt% gelled at 25 °C and even at 37 °C they held viscosities &#8805; 10 mPa s, which are too high for commercial inkjet print heads. Conversely, solutions of highly methacrylated gelatin with mass fractions up to 15 wt% possessed inkjet-compatible viscosities, at both 25 °C and 37 °C. Additional acetylation of gelatin derivatives holding low degrees of methacrylation succeeded in masking of free amino groups without changing the amount of crosslinkable methacrylic functions. The resulting reduction of inter- and intramolecular interactions of the gelatin macromonomers allowed the preparation of solutions with inkjet-suitable viscosities based on these slightly methacrylated gelatins. Thus, twofold functionalization of gelatin by acetylation and methacrylation enabled formulation of gelatin-based bioinks with a wide range of the resulting hydrogels’ physical properties. The biopolymer-based material systems were processed as bioinks by a piezoelectric microdispensing system. Thereby, at a printing temperature of 25 °C a stable printing process was successfully established. Furthermore, it could be shown that such processing was cytocompatible for chondrocytes. In this way, gelatin- and chondroitin sulfate-based bioinks suitable for inkjet bioprinting were developed. These bioinks may be crosslinked into hydrogels holding mechanical properties of various native tissues. Thus, these material systems offer considerably potential to generate functional tissue mimetics, such as articular cartilage, with biomimetic compartmentalisation and microstructure.