Role of inflammatory cytokine signaling in the regulation of detoxifying functions in human hepatocytes and liver

Abstract

During inflammation, circulating pro-inflammatory cytokines such as TNFα, IL-1ß, and IL-6, which are produced by, e.g., Kupffer cells, macrophages, or tumor cells, play important roles in hepatocellular signalling pathways and in the regulation of cellular homeostasis. In particular, these cytokines are responsible for the acute phase response (APR) but also for a dramatic reduction of drug detoxification capacity due to impaired expression of numerous genes coding for drug metabolic enzymes and transporters (DMETs). Several pathways are known to be activated by IL-6 such as the JAK/STAT, MAPK/ERK, and PI3K/AKT pathways. Earlier work by others has shown that downregulation of CYP3A4 is independent of the JAK/STAT and MAPK/ERK pathways. However, there is evidence that MAPKs are able to phosphorylate nuclear receptors (NRs) such as RXR-α, which alters their function. Moreover, AKT, downstream of PI3K, may induce nuclear translocation of NF-κB which antagonizes RXR-α and other NRs. RXR-α, which heterodimerizes with subfamily 1 NRs (e.g., CAR and PXR), is an important regulator of detoxifying functions in liver. Inhibition of RXR-α or other NRs could therefore explain the simultaneous downregulation of large gene batteries including many DMET genes. The contributing signaling events and mechanisms remained, however, largely unexplained. Therefore, the major focus of this thesis was the investigation of the impact of the major inflammatory mediator IL-6 on the regulation of detoxifying functions in human liver. For this purpose, a large-scale investigation of DMET gene expression changes in IL-6-stimulated primary human hepatocytes (PHH) was carried out. Many important DMET genes were found to be downregulated in response to IL-6 stimulation of PHH. Most significantly suppressed were genes coding for cytochrome P450s (e.g., CYP1A2, 2C9, 2D6, and 3A4) and ATP-binding cassette (e.g., ABCB1 and ABCC2) and solute carrier (e.g., SLC10A1 and SLCO1B1) drug transporters. The average phase II metabolism gene expression appeared to be only moderately affected by IL-6, showing much stronger variability in gene expression, including genes with a trend towards upregulation (SULTs). Most notably, CYPs appeared to be highly downregulated in a coordinated fashion, demonstrating the broad suppressive potency of IL-6 towards this particular family of drug metabolizing enzymes (DMEs). Moreover, determination of metabolite formation rates in IL-6-treated PHH revealed impaired metabolic functionality of the major CYP isoenzymes CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, and 3A4. Therefore, it was shown that IL-6 signaling extensively interferes with drug detoxification capacity in human hepatocytes. Phosphoprotein analyses revealed activation of the JAK/STAT, MAPK, and PI3K cascades by IL-6. Whereas individual chemical inhibition of the two latter pathways attenuated many IL-6-mediated effects on DMET gene expression, co-inhibition almost completely abolished these effects. Inhibition of JAK/STAT signaling barely affected IL-6-mediated effects. Notably, activation of PI3K and knock-down (KD) of RXR-α demonstrated strikingly similar DMET gene expression patterns compared to IL-6 stimulation. Therefore, these data indicated a MAPK/ERK- and PI3K/AKT-dependent but JAK/STAT-independent downregulation of DMET genes in response to IL-6, possibly via interference with RXR-α. In conclusion, these data suggest that MAPKs and AKT-activated NF-κB antagonize NR signaling, causing a coordinated downregulation of DMET genes. The investigation of sensitive regulatory mechanisms is complicated by the interindividual variability of PHH. The human hepatocellular carcinoma derived HepaRG cell line has been shown to retain many functional characteristics of PHH, including the expression of functional DMETs, but the influence of inflammation has not been investigated so far. Thus, HepaRG cells were tested for their robustness and suitability in studying the inflammation-mediated impact on the drug detoxification capacity in human liver. Indeed, IL-6 stimulation of HepaRG cells led to highly induced expression of acute phase (AP) genes (e.g., CRP) and significantly repressed DMET gene expression in a coordinated fashion. The selectivity and magnitude of these effects were strikingly similar to those observed in IL-6-exposed PHH, with only few exceptions (e.g., CYP2E1 and SULTs). This was further supported by a strong positive correlation of IL-6-mediated expression changes of DMET and critical modifier genes in both cell models. Moreover, decreased protein expression and activity of major P450s could be determined in HepaRG cells, comparable to PHH. Exposure of HepaRG cells to different cytokines resulted in moderately different gene expression patterns, indicating specific responsiveness to particular pro-inflammatory cytokines. These data indicate that HepaRG cells retain the regulatory mechanisms that are responsible for the downregulation of the liver’s drug detoxification capacity during inflammation. This cell line may therefore provide a good alternative model for detailed mechanistic analyses during such conditions. The inflammation-mediated transcriptional changes that have major effects on drug detoxification in the liver have not been analyzed on a transcriptome-wide scale so far. Therefore, the last part of this work focused on the unbiased assessment of genome-wide transcriptional changes in response to inflammatory signaling in the human liver. For this purpose, microarray analysis was carried out in IL-6-stimulated PHH and compared to transcriptome data, previously acquired in samples from a liver cohort, including patients having undergone an APR (elevated CRP). Remarkably, major human-relevant CYPs, 2C8, 3A4, and 2A6 were the most strongly downregulated genes in IL-6-challenged PHH. Their transcription was at least 4-fold repressed. A total of 40 DMET genes were identified as significantly altered, of which 30 were downregulated, including almost all transcripts of major CYPs of importance in humans (e.g., 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 3A4 and 3A5), phase II drug metabolizing enzymes (e.g., GSTAs, SULTs and UGTs), and drug transporters (ABCs and SLCs). In liver samples from patients with elevated CRP, 29 DMET genes were downregulated including important genes coding for phase I/II drug metabolizing enzymes (e.g., ADHs, ALDHs, CYPs, GSTs and UGTs) and drug transporters (e.g., ABCG2 and SLCs). In both studies, gene term enrichment analyses indicated a very strong influence on xenobiotic metabolic and related processes, containing mostly downregulated DMET genes. Moreover, pathway enrichment (KEGG) analyses revealed that drug and xenobiotic metabolic signaling pathways were the most strongly impacted reaction networks, clearly demonstrating that the drug detoxification system in the liver is largely affected during inflammation. Gene annotation analysis also identified enriched processes related to diverse lipid metabolic processes such as fatty-acid and steroid metabolism. Moreover, enriched biological processes and regulatory pathways related to amino acid metabolism were found, particularly in the retrospective study. The data indicated a conservation and allocation of specific amino acids, possibly in favor of acute phase protein (APP) synthesis. Taken together, these findings highlight the scale on which the human liver transcriptome is affected during inflammation. Extensive reorganization related to xenobiotic, lipid, and amino acid metabolism takes place. It appears that the liver devotes its transcriptional machinery to the immune response while other major liver functions are shut down. This may help to pave the way towards a better understanding of how the liver organizes its many responsibilities in different conditions.

Die Entzündungsreaktion ist vor allem von pro-entzündlichen Zytokinen, wie z.B. TNF-α, IL 1β und IL-6, geprägt. Diese werden u.a. von Kupffer-Zellen, Makrophagen und Tumorzellen produziert und spielen eine wichtige Rolle in hepatozellulären Signalwegen sowie in der Regulation der zellulären Homöostase. Hauptsächlich aktivieren diese Zytokine die Akut-Phase-Reaktion (APR), beeinflussen jedoch gleichzeitig die Genexpression von vielen arzneimittelmetabolisierenden Enzymen und Transportern (AMET), was zu einer dramatischen Verminderung der Kapazität des Arzneimittelstoffwechsels (Fremdstoffmetabo-lismsus) führen kann. IL-6 aktiviert verschiedene Signalkaskaden, wie z.B. JAK/STAT, MAPK/ERK und PI3K/AKT. Frühere Arbeiten zeigten eine JAK/STAT- und MAPK/ERK-unabhängige Herunterregulation des bedeutenden Cyotochroms P450 (CYP)3A4. Es gibt jedoch Hinweise, dass MAP-Kinasen Kernrezeptoren (nukleäre Rezeptoren, NRs), wie z.B. RXR-α, phosphorylieren und somit deren Funktion verändern. Möglicherweise kann die AKT-Kinase, welche der PI3-Kinase nachgeschaltet ist, die nukleäre Translokation von NF κB induzieren, was zu einer Antagonisierung von RXR-α und anderer NRs führen kann. RXR-α, welches mit anderen NRs der Unterfamilie 1 (z.B. CAR und PXR) dimerisiert, ist ein wichtiger Regulator der Entgiftungsfunktion der Leber. Eine Inhibition dieses oder anderer NRs könnte daher eine koordinierte Herunterregulation von ganzen Gengruppen inklusive vieler AMET-Gene erklären. Die beteiligten Signaltransduktionswege und Mechanismen sind jedoch noch größtenteils ungeklärt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des wichtigen pro-entzündlichen Mediators IL-6 auf die Entgiftungskapazität der Leber sowie dessen Regulation zu untersuchen. Dafür wurde mittels Hochdurchsatz-qPCR auf mikrofluidischen Chips (Fluidigm) eine umfangreiche Analyse von AMET-Genexpressionsänderungen in IL-6-behandelten primären humanen Hepatozyten (PHH) durchgeführt. Viele wichtige AMET-Gene waren herunterreguliert. Am stärksten supprimiert waren Gene, welche für CYPs (z.B. CYP1A2, 2C9, 2D6 und 3A4) und Transportproteine der ABC- (z.B. ABCB1 und ABCC2) sowie SLC-Familie (z.B. SLC10A1 und SLCO1B1) kodieren. Die Expression von Genen des Phase II-Metabolismus waren nur moderat betroffen und zeigten eine sehr viel stärkere Variabilität, mit teilweise erhöhter Expression (SULTs). Vor allem für die CYP-Gene war eine sehr koordinierte Reaktion auf die IL-6-Stimulation in PHH auffallend. Übereinstimmend dazu konnten anhand von spezifischen Marker-Reaktionen eine Beeinträchtigung der Aktivität der wichtigen Isoenzyme CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19 und 3A4 bestimmt werden. Es wurde somit gezeigt, dass die IL-6-Signalwirkung störend in den Fremdstoffmetabolismus in humanen Hepatozyten eingreift. Mittels Phosphoprotein-Mikroarray-Analysen konnten eine IL-6-abhängige Aktivierung der JAK/STAT-, MAPK- und PI3K-Signalkaskaden gezeigt werden. Während eine individuelle chemische Hemmung der MAPK- oder PI3K-Kaskade viele Effekte abschwächte, führte deren gleichzeitige Hemmung fast vollständig zur Aufhebung der IL-6-vermittelten Effekte auf die AMET-Genexpression. Eine Hemmung des JAK/STAT-Signalwegs hatte nur einen geringen Einfluss auf die IL-6-vermittelten Effekte. Interessanterweise führten die Aktivierung von PI3K sowie der Knockdown (KD) von RXR-α im Vergleich zur IL-6-Stimulation zu bemerkenswert ähnlichen AMET-Genexpressionsmustern. Demzufolge deuten diese Ergebnisse auf eine MAPK/ERK- und PI3K/AKT-abhängige, jedoch aber JAK/STAT-unabhängige, IL-6-vermittelte Herunterregulation von AMET-Genen hin. Möglicherweise geschieht dies durch Interaktion mit RXR-α. Zusammenfassend geben diese Daten zu erkennen, dass sowohl MAP-Kinasen als auch durch AKT aktiviertes NF-κB NR-Signalwege antagonisieren und somit zu einer koordinierten Repression von AMET-Genen führen können. Die interindividuelle Variabilität von primären Hepatozyten erschwert die Untersuchung von sensitiven regulatorischen Mechanismen. In der hepatozellulären Karzinomzelllinie HepaRG sind viele Eigenschaften von PHH erhalten inklusive der funktionellen Expression von AMET. Der Einfluss der Entzündungsreaktion auf den Arzneimittelmetabolismus wurde in dieser Zelllinie jedoch noch nicht untersucht. Folglich wurden HepaRG Zellen für ihre Eignung sowie Robustheit in der Erforschung der entzündungsvermittelten Wirkung auf den Medikamentenstoffwechsel in der humanen Leber untersucht. Tatsächlich führte eine IL-6-Stimulation in HepaRG zu einer stark erhöhten Expression von Akut-Phase (AP) Genen (z.B. CRP) sowie zu einer koordinierten Herunterregulation der AMET-Genexpression. Selektivität und Ausmaß der Effekte waren denen in IL-6-behandelten humanen Hepatozyten sehr ähnlich, mit nur wenigen Ausnahmen (z.B. CYP2E1 und SULTs). Dies wurde bestätigt durch eine stark positive Korrelation von IL-6-vermittelten Expressionsänderungen von AMET-Genen sowie wichtigen Modulatoren in beiden Zellmodellen, PHH und HepaRG. Des Weiteren konnten in HepaRG Zellen, ähnlich wie in PHH, eine verminderte Proteinexpression sowie Aktivität von wichtigen Cytochromen P450 bestimmt werden. Die Behandlung von HepaRG Zellen mit verschiedenen Zytokinen resultierte in differenziellen Genexpressions-mustern, was auf eine spezifische Empfindlichkeit gegenüber bestimmten pro-entzündlichen Zytokinen hinweist. Insgesamt zeigen diese Daten, dass HepaRG Zellen die regulatorischen Mechanismen der Herunterregulation des Fremdstoffmetabolismus während einer Entzündung bewahren. Diese Zelllinie könnte somit ein gutes alternatives Modellsystem für mechanistische Analysen während pathophysiologischer Bedingungen, wie Entzündungen, darstellen. Die durch Entzündung verursachten Genexpressionsänderungen, welche schwerwiegende Auswirkungen auf den Arzneimittelmetabolismus in der Leber haben, wurden bisher noch nicht auf transkriptomweiter Ebene untersucht. Somit wurden im letzten Teil dieser Arbeit mittels Mikroarray-Analysen die genomweiten Transkriptveränderungen in Folge einer Entzündungsreaktion in der humanen Leber gemessen. Es wurden Transkriptomdaten von IL 6-behandelten PHH mit bereits verfügbaren Daten aus einer Leberkohorte, welche Patienten mit einer APR einschloss (erhöhtes CRP), verglichen. Bemerkenswerterweise zählten die wichtigen CYPs 2C8, 3A4 und 2A6 zu den am stärksten herunterregulierten Genen in IL-6-behandelten PHH. Deren Transkription war mindestens vierfach reprimiert. Insgesamt wurden 40 signifikant veränderte AMET-Gene identifiziert, von denen 30 herunterreguliert waren, inklusive vieler Transkripte von wichtigen CYPs (z.B. 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 3A4 und 3A5), Phase II-metabolisierenden Enzymen (z.B. GSTAs, SULTs und UGTs) sowie Medikamententransportern (ABCS und SLCs). In Leberproben von Patienten mit einem erhöhten CRP-Serumlevel waren 29 AMET-Gene herunterreguliert. Diese umfassten wichtige Gene, welche für Phase I/II-metabolisierende Enzyme (z.B., ADHs, ALDHs, CYPs, GSTs und UGTs) sowie Medikamententransporter (z.B. ABCG2 und SLCs) kodieren. Genannotations-analysen in beiden Studien deuteten auf einen sehr starken Einfluss auf Prozesse des Fremdstoffmetabolismus hin, welche hauptsächlich herunterregulierte AMET-Gene enthalten. Des Weiteren zeigte eine Signalweg-Analyse (KEGG), dass die am stärksten beeinflussten Netzwerke dem Medikamenten- sowie dem Fremdstoffmetabolismus angehörten. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das Entgiftungssystem der Leber während einer Entzündung stark beeinträchtigt wird. Weitere Genannotationsanalysen zeigten außerdem eine An-reicherung von diversen Fettstoffwechselprozessen, wie z.B. des Fettsäure- und Steroid-stoffwechsels. In den Leberproben von Patienten mit erhöhtem CRP-Serumlevel waren ferner vermehrt biologische Prozesse und Signalwege betroffen, welche dem Aminosäure-stoffwechsel angehören. Die Daten deuteten auf eine Konservierung sowie eine gerichtete Verteilung von spezifischen Aminosäuren, zugunsten der Akut-Phase-Protein (APP)-Synthese, hin. Zusammenfassend zeigen diese Daten das Ausmaß, in welchem das Transkriptom der humanen Leber während einer Entzündung beeinflusst wird. Eine umfang-reiche Reorganisation des Fremdstoff-, Fett- und Aminosäurestoffwechsel findet statt. Es scheint, als ob die Leber ihre transkriptionelle Maschinerie der Immunantwort widmet während andere wichtige Leberfunktionen eingestellt werden. Diese Beobachtungen könnten den Weg in Richtung eines besseren Verständnisses der Leber, ihrer Funktionen und wie diese ihre diversen Aufgaben unter verschiedenen Bedingungen organisiert und anpasst, ebnen.