Population and single-cell based quantitative analysis of protein kinase D-mediated regulation of the cell cycle

Abstract

The cell cycle consists of G1, G2, S, and M phase and is a tightly regulated process with various checkpoints to control order and length of the separate phases. A multitude of signal molecules and pathways are involved in this process. In cancer, cell cycle control is often changed and understanding of these changes may result in new therapeutic targets in the treatment of patients. Additionally, cell cycle control is of special interest in stem cells as important decisions of cell fate – to proliferate or to differentiate - are part of cell cycle control. The success of adult stem cell therapeutic applications is thus dependent on in-depth understanding of this regulation. The Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (Fucci) is a sophisticated technology, which can easily determine G1 and/or S/G2/M phases of the cell cycle. The technology analyzes living cells in a spatio-temporal manner using fusion proteins consisting of two distinct cell cycle proteins fused to two fluorophores - a dual color scheme of orange and green. The aim of this thesis was to characterize the influence of Protein kinase D (PKD) using this technology in cells with adult stem cell characteristics and an established human cancer cell line. At first, a characterization of primary human mesenchymal stromal cells (MSC) derived from umbilical cord (UC) and bone marrow (BM) was performed. Furthermore, murine bone marrow stromal cells (mBMSCs) were isolated and osteogenic differentiation was investigated in tissue culture and in vivo. Three out of seven independent cell isolates showed the ability to differentiate into osteocytes, adipocytes, and chondrocytes in vitro. In vitro multipotency of an established mBMSC line was maintained over 45 passages. The osteogenic differentiation of this cell line was confirmed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis of specific markers such as osteocalcin and shown to be Runx2 dependent. Notably, the cell line, when transplanted subcutaneously into mice, possesses full skeletal stem cell characteristics in vivo in early and late passages, evident from bone tissue formation, induction of vascularization, and host derived hematopoiesis. This cell line provides, thus, a versatile tool to unravel the molecular mechanisms governing osteogenesis in vivo thereby aiding to improve current strategies in bone regenerative therapy. Consequently, multipotent mBMSC lines were established from transgenic Fucci mice. Single cell analysis of cell cycle progression was performed in these Fucci-mBMSCs and Fucci transgenic human HeLa cells. Specifically, the influence of protein kinase D (PKD) and the RAF/MEK/ERK pathway on progression through S/G2/M phase was investigated in detail. Inhibition of PKD but not of MEK resulted in a delay in progression through S/G2/M phase in HeLa cells and mBMSCs. Furthermore, MAPK pathway activation was quantitatively assessed during the synchronous progression of HeLa cells through S/G2/M and successfully used to develop a quantitative mathematical model describing this pathway. Taken together this study demonstrates the benefit of quantitative and single cell analysis in cells with stem cell characteristics and an established cell line to enlighten the role of PKD in cell cycle control and, on top of that, support the notion that PKD is a potential new target for cancer therapy.

Der Zellzyklus ist ein streng regulierter Prozess, der aus vier verschiedenen Phasen, G1, S, G2 und M, besteht. Die Dauer und Abfolge dieser Phasen unterliegen verschiedenen Kontrollmechanismen. Eine Deregulation des Zellzyklus durch Verlust dieser Kontrollmechanismen kann zu einer unkontrollierten Zell-Vermehrung führen und damit grundlegend für eine maligne Transformation von Zellen sein. Die Identifizierung dieser Veränderungen in der Zellzyklusregulation von Tumorzellen kann daher neue Strategien für Therapieansätze in betroffenen Patienten aufzeigen. Die Zellzyklus-Regulation ist auch in der Stammzellforschung von besonderem Interesse, da der Erfolg von Therapieanwendungen mit adulten Stammzellen von einem grundlegenden Verständnis der Mechanismen, die über Proliferation und Differenzierung von Stammzellen entscheiden, abhängt. Das fluoreszierende, auf Ubiquitinierung basierende Zellzyklus Indikator System (Fucci) ist eine elegante Methode, mit deren Hilfe G1 und/oder S/G2/M Phasen des Zellzyklus mikroskopisch bestimmt werden können. Durch genetische Konstruktion von Fusionsproteinen bestehend aus zwei verschiedenen, spezifischen Zellzyklusproteinen und zwei fluoreszierenden Reporterproteinen – orange und grün- ist es möglich lebende Zellen kontinuierlich über einen längeren Zeitraum zu analysieren. In dieser Arbeit sollte die Funktion der Proteinkinase D (PKD) in der Zellzykluskontrolle mit Hilfe dieses Systems untersucht werden. Zur Untersuchung wurden zum einen Zellen mit adulten Stammzelleigenschaften und zum anderen eine etablierte humane Krebszelllinie verwendet. Zu Beginn wurde in dieser Arbeit eine Charakterisierung von primären humanen mesenchymalen Stromazellen (MSC), die aus der Nabelschnur (UC) und dem Knochenmark (BM) gewonnen wurden, durchgeführt. Des Weiteren wurden Stromazellen aus dem Knochenmark der Maus (mBMSC) isoliert und die osteogene Differenzierung in vitro und in vivo untersucht. Drei von sieben unabhängigen Zellisolaten differenzierten in vitro zu Osteozyten, Adipozyten und Chondrozyten. Diese in vitro Multipotenz konnte in einer in dieser Arbeit etablierten mBMSC Zelllinie über 45 Passagen erhalten werden. Die osteogene Differenzierung dieser Zelllinie wurde durch den Nachweis der Genexpression des spezifischen Markers Osteocalcin bestätigt. Weiterhin wurde gezeigt, dass diese osteogene Differenzierung vom Transkriptionsfaktor Runx2 abhängig verläuft. Besonders interessant macht diese Zelllinie, dass sie in vivo die Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen in frühen sowie späten Passagen besitzt: Nach subkutaner Transplantation in Mäuse, konnte die Differenzierung zu Knochengewebe, die Induktion von Vaskularisierung und Hämatopoese gezeigt werden. Diese Zelllinie kann deshalb als vielseitiges Werkzeug eingesetzt werden um die molekularen Zusammenhänge, die die Osteogenese kontrollieren besser zu verstehen und aktuelle Strategien in der Knochen-Regenerationstherapie zu verbessern. Einzelzellanalysen der Zellzyklus-Progression wurden in Fucci-mBMSCs, die aus transgenen Fucci-Mäusen isoliert wurden, und in Fucci-HeLa Zellen durchgeführt. Im Detail wurde besonders der Einfluss von PKD und des RAF/MEK/ERK Signalweges auf die Dauer der S/G2/M Phase untersucht. Die Inhibition von PKD aber nicht die von MEK führte zu einer Verlängerung der S/G2/M Phase in HeLa Zellen und mBMSC. Des Weiteren wurde die Aktivierung des MAPK Signalwegs während des synchronen Durchlaufs von HeLa Zellen durch die S/G2/M Phase bestimmt. Diese Daten wurden benutzt, um ein mathematisches Modell, das diesen Signalweg beschreibt, zu erstellen. Zusammenfassend zeigt diese Studie den Nutzen von quantitativer und Einzelzellanalyse in Zellen mit Stammzellcharakteristiken und etablierten Zelllinien, um die Rolle von PKD in der Zellzyklusregulation aufzuklären. Die hier erhaltenen Ergebnisse legen eine detailliertere, präklinische Untersuchung von PKD-Inhibitoren nahe, um deren potentiellen Einsatz in der Krebstherapie zu prüfen.