Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-2353
Authors: Körner, Jan Lennart
Title: Target identification and probe development for pancreatic neuroendocrine tumors
Other Titles: Identifizierung von Zielstrukturen und Sondenentwicklung für pankreatische neuroendokrine Tumore
Issue Date: 2015
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-99204
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2370
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2353
Abstract: Early diagnosis and targeted therapy are pivotal tools for the treatment success of neuroendocrine tumors. The use of somatostatin analogs brought great benefits for NET patients, especially for inoperable or metastasized gastroenteropancreatic tumors. However, this treatment modality cannot be applied in all cases. Around one third of tumors do not overexpress somatostatin receptors, thus are not susceptible for octreotide or similar SST analogs. Further G protein-coupled receptors (GPCR) have to be investigated in neuroendocrine tumors for their use in alternative targeting approaches. A novel DNA microarray was developed, for investigation of 368 genes, most of them GPCRs (357). This array was designed to detect differential splice variants and expression levels in parallel. Pancreatic neuroendocrine tumor samples and control pancreas tissue were hybridized on these DNA microarrays. After applying splice detection and expression level analysis tools, several novel potential targets where identified (for example GIPR, MC1R, FN1, TUBB3). These newly found receptors and extracellular matrix proteins were validated with higher sample numbers, in both protein- (Western-blot, immunohistochemistry) and mRNA-based (qPCR) assays. For peptide G protein-coupled receptors, the two highly overexpressed genes MC1R and GIPR were identified and validated. Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) has been shown to have similar expression levels as somatostatin receptor 2 in pancreatic and ileal neuroendocrine tumors. The NET cell lines H727 and KRJ-1 can be stimulated in functional cAMP production assays with the human GIP1-42 peptide ligand. In direct comparison, MC1R is, on an absolute scale, less expressed than GIPR but shows still a very high significant differentially expression towards healthy control tissues. Neuroendocrine human cell lines LCC-18 and CM could be stimulated by applying both alpha-melanocortin but as well MC1R specific peptides and small molecules. In a two rounds of peptide optimization, 43 novel ligands were designed. These have been analyzed in cyclic adenosinmonophosphat production assays and in radioactive receptor-ligand binding studies with the human melanocortin 1, 3, 4 and 5 receptors. Here, several highly potent and very specific MC1R ligands were designed which are composed of one C-terminal fatty acid and four amino acids. These novel compounds will be evaluated for their potential use in diagnostic or therapeutic application in the future.
Eine frühzeitige Diagnose und zielgerichtete Therapien führten bei Patienten mit neuroendokrinen Tumoren zu erheblichen Verbesserungen. Somatostatin Analoga (z.B. Octreotid) sind besonders bei inoperablen und metastasierenden gastroenteropankreatischen Tumoren wirksam und stellen neben klassischer Chemotherapie die einzige Alternative dar. Allerdings kann diese zielgerichtete Therapie nicht für alle Patienten sinnvoll eingesetzt werden. Bei ungefähr einem Drittel der NET Tumoren kommt es nicht zu einer Somatostatin Rezeptor Überexpression, folglich erfolgt keine Bindung des Somatostatin Analogons an den Tumor. Weitere G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sollten auf eine Expression im neuroendokrinen Tumor untersucht werden. Für diesen Zweck wurde ein DNA Microarray entwickelt, mit dessen Hilfe 368 Gene, davon 357 GPCRs, analysiert wurden. Mit diesem DNA Chip war es möglich differenzielle Spleißvarianten und Genexpression parallel zu untersuchen. Pankreatische neuroendokrine Tumore und die jeweiligen Kontrollgewebe wurden auf den Arrays hybridisiert. Durch Anwendung zweier Detektionsalgorith-men für Spleißvarianten und der Analyse auf Genexpressionsunterschiede wurden mehrere potentielle neue Tumor Zielstrukturen identifiziert (z.B GIPR, MC1R, FN1, TUBB3). Diese Ergebnisse wurden in weitern Analysen mit höheren Fallzahlen validiert. Es wurden sowohl proteinbiochemische Versuche (Western-Blots und Immunhistochemie) als auch auf mRNA Ebene basierte Quantifizierung der Genexpression untersucht. Auf Seiten der G Protein-gekoppelten Rezeptoren wurden die zwei im Tumor hochregulierte Gene MC1R und GIPR identifiziert und validiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) ähnlich hohe Expressionwerte wie Somatostatin Rezeptor 2 im Tumor besitzt. Des Weiteren wurden zwei der sechs humanen neuroendokrinen Zelllinien identifiziert (H727 und KRJ-1), welche den GIP Rezeptor funktionell exprimieren. Diese Zelllinien konnte durch das humane Peptid GIP1-42 zur zyklischen Andenosinmonophosphat Produktion angeregt werden. Im Kontrast dazu, zeigte der Melanocortin Rezeptor 1 (MC1R) eine deutlich erniedrigte absolute Expression. Allerdings konnte im Vergleich zum jeweiligen Kontrollgewebe eine signifikante Erhöhung der MC1R mRNA, sowohl im Ileum als auch im Pankreas, gezeigt werden. Auch hier wurden zwei neuroendokrine Zelllinien gefunden, welche funktionell den MC1 Rezeptor exprimieren (LCC-18, CM). Dieses Ergebnis wurde des weiteren in radioaktiven Bindungsstudien bestätigt. Es wurden von uns 43 neue Liganden entwickelt und sowohl im zyklischen Adenosinmonophosphat Assay als auch in radioaktiven Rezeptor-Ligand Bindungsstudien auf ihre Aktivität und Spezifität ge-genüber den humanen Melanocortinrezeptoren (1, 3, 4 und 5) untersucht. Mehrere neue Liganden wurden identifiziert welche die von uns gewünschte hohe Aktivität und Spezifität gegenüber MC1R zeigten. Diese neuen Substanzen stellen potentiell interessante Moleküle für diagnostische oder therapeutische Anwendungen da.
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