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Authors: Sauter, Thomas
Title: Die bakterielle Signalverarbeitung am Beispiel des Sucrose Phosphotransferasesystems in Escherichia coli : Modellierung und experimentelle Überprüfung
Other Titles: Bacterial signal transduction via the sucrose phosphotransferase system in Escherichia coli : Modeling and experimental validation
Issue Date: 2004
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-19206
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/4041
http://dx.doi.org/10.18419/opus-4024
Abstract: Die bakterielle Signalverarbeitung wurde am Beispiel des Sucrose Phosphotransferasesystems (Sucrose PTS) im Bakterium Escherichia coli untersucht. Die etwa 20 verschiedenen Phosphotransferasesysteme (PTSs) der Zelle erfüllen neben dem Transport zahlreicher Kohlenhydrate auch die Funktion eines signalverarbeitenden Systems. Extra- und intrazelluläre Signale werden in der aus vier Proteinen bestehenden Kette in wichtige regulatorische Signale umgesetzt, die vor allem in den Kohlenstoffmetabolismus und die Chemotaxis eingreifen. Zur Beschreibung sowohl der Tranport-, als auch der Signalverarbeitungsfunktion, wurde ein detailliertes dynamisches mathematisches Modell des Sucrose PTS entwickelt. Es wurde hierzu eine detaillierte Beschreibung der Komplexbildung und des Phosphoryltransfers zwischen den einzelnen Proteinen der Proteinkette verwendet. Die Parameter des Modells konnten aus der Literatur entnommen, beziehungsweise aus eigenen Messungen identifiziert werden. Unter Verwendung eines formalen Algorithmus mit Clusteranalyse konnten das PTS und die Glykolyse als biologische Funktionseinheiten mit begrenzter Autonomie identifiziert werden. Simulationsstudien gestützt von experimentellen Beobachtungen zeigten, dass sich das dynamische Verhalten des Phosphoryltransfers innerhalb des PTS im Bereich einer Sekunde abspielt, sodass für eine ganzheitlichere Betrachtung der regulatorischen Funktion des PTS im metabolischen Netzwerk stationäre Kennlinien ausreichend sind. Es wurde ein Kennlinienfeld zur Beschreibung der Abhängigkeit des Phosphorylierungsgrad des PTS-Proteins EIIACrr von den Eingangsgrößen extrazelluläre Sucrosekonzentration und intrazelluläres PEP:Pyruvat-Verhältnis verwendet. Zur Überprüfung des Modells wurden Fermentationsexperimente unter Verwendung eines Sucrose-positiven Escherichia coli W3110-Derivats durchgeführt. Es wurde hierzu eine Methode zur Bestimmung intrazellulärer Metabolitkonzentrationen entwickelt, bei der ein kochendes Ethanol-Puffer-Gemisch verwendet wird. Des Weiteren wurde der Phosphorylierungsgrad des Proteins EIIACrr als PTS-Ausgangsgröße gemessen. Im Rahmen der durchgeführten Experimente wurden sowohl stationäre Bedingungen bei verschiedenen Verdünnungsraten und Gelöstsauerstoffkonzentrationen, als auch dynamische Veränderungen mittels verschiedener Anregungen über die extrazelluläre Sucrosekonzentration betrachtet. Es wurden hierzu Puls-, Sprung- und Fütterungsstop-Experimente durchgeführt. Die Übereinstimmung zwischen Experiment und Simulationsergebnissen erwies sich nach Parameteranpassung als gut. Gleiches gilt auch für ein erweitertes Modell, das die Glykolyse mit einschließt.
Bacterial signal processing was investigated concerning the sucrose phosphotransferase system (sucrose PTS) in the bacterium Escherichia coli as an example. The about 20 different phosphotransferase systems (PTSs) of the cell fulfil besides the transport of various carbohydrates, also the function of one signal processing system. Extra- and intracellular signals are converted within the PTS protein chain to important regulatory signals affecting e.g. carbon metabolism and chemotaxis. A detailed dynamical model of the sucrose PTS was developed describing transport and signal processing function. It was formulated using a detailed description of complex formation and phosphate transfer between the chain proteins. Model parameters were taken from literature or were identified with own experiments. Using a formal algorithm including cluster analysis, PTS and glycolysis could be identified as biological functional units with limited autonomy. Simulation studies together with experimental hints showed that the dynamic behaviour of phosphate transfer in the PTS runs within one second. Therefore a description of steady state characteristics is sufficient for describing the signaling properties of the sucrose PTS. A steady state characteristic field describes the degree of phosphorylation of the PTS protein EIIACrr as a function of the input variables extracellular sucrose concentration and intracellular PEP:pyruvate ratio. The model has been validated with different experiments performed in a CSTR using an sucrose positive Escherichia coli W3110 derivative. A method for determining intracellular metabolite concentrations has been developed. A sample preparation technique using a boiling ethanol buffer solution was successfully applied. The PTS output signal degree of phosphorylation of EIIACrr was also measured. Steady state conditions with varying dilution rate and dissolved oxygen concentration and dynamical variations applying different stimuli to the culture were considered. Pulse, and stop feeding experiments with limiting sucrose concentrations were performed. Simulation and experimental results matched well. The same holds for the expanded sucrose PTS and glycolysis model.
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