Einzelmolekülspektroskopie in lebenden Zellen : Untersuchung und Anwendung alternativer Fluoreszenzmarkierungen mit verbesserten photophysikalischen Eigenschaften

Abstract

Die Methoden der Einzelmolekülspektroskopie werden seit Mitte der 90er Jahre in ansteigendem Maße für Untersuchungen in Modellsystemen in der Biochemie und Molekularbiologie angewandt. Die Anwendung dieser Methoden auf biologische Fragestellungen zu Untersuchungen in lebenden Zellen stellt dagegen ein noch junges und noch kaum verbreitetes Fachgebiet dar. Die Herausforderungen, Einzelmolekülspektroskopiemethoden, die in Modellsystemen etabliert wurden, auf die Bedingungen in lebenden Zellen zu übertragen, liegen in einem verminderten Signal-Rausch-Verhältnis und in der Notwendigkeit, bestimmte Moleküle in ihrer zellulären Umgebung hoch spezifisch zu markieren. Um eine größere Verbreitung dieser Methoden zur direkten Untersuchung biologischer Fragestellungen in lebenden Zellen zu erreichen, sind Verbesserungen vor allem der photophysikalischen Eigenschaften der Fluoreszenzmarkierungen gegenüber den bisher verbreiteten Markierungen notwendig.

In dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt, Konzepte zu alternativen Fluoreszenzmarkierungen im Hinblick auf verbesserte photophysikalische Eigenschaften zu untersuchen und anzuwenden. Zum einen wurden an fluoreszierenden Nanodiamanten mit NV-Zentren eine Reihe von Experimenten durchgeführt mit dem Ziel, diese als Fluoreszenzmarkierung zur Anwendung in lebenden Zellen zu etablieren. Zum Anderen wurde die bislang wenig verbreitete Markierungsmethode der Tags (ACP-Tag) genutzt, um die Vorteile einer genspezifischen Markierung von autofluoreszierenden Proteinen und die photophysikalischen Eigenschaften von synthetischen Farbstoffen zu kombinieren. Das gegenüber autofluoreszierenden Proteinen erhöhte Signal-Rausch-Verhältnis führte hierbei zu Resultaten, die bei der Verwendung von autofluoreszierenden Proteinen nicht zu erreichen gewesen wären.

Die Anwendung der in dieser Arbeit vorgestellten Methoden der Einzelmolekülspektroskopie ermöglicht es, zellbiologische Fragestellungen zu beantworten, die mit bisher etablierten zellbiologischen Methoden nicht untersucht werden konnten. In den letzten Jahren wurden solche Methoden bereits in kommerzielle Systeme eingeführt bzw. sie stehen in der Entwicklung. So ist in den kommenden Jahren eine weitere Verbreitung der Methoden der Einzelmolekülspektroskopie insbesondere unter Biologen und Medizinern zu erwarten.

Since the nineties single-molecule fluorescence techniques have been used for investigations in molecular biology and biochemistry. The application of single-molecule fluorescence techniques allows addressing biological questions which were inaccessible via ensemble measurements. Dynamic interactions of nucleic acids and proteins can be probed by Förster resonance energy transfer (FRET), single-particle tracking can follow the trajectory of single-molecules over distances of microns, and fluorescence fluctuation analysis yields information on concentration, diffusion behavior and binding of proteins.

Even though these techniques are now established as powerful tools that can reveal the dynamic behavior of proteins and nucleic acids, the application of single-molecule techniques in live cells remains challenging. To use single-molecule techniques in live cells, one has to overcome a decreased signal-to-noise ratio caused by the high auto-fluorescence of the cell. Another crucial point is the necessity of high specificity in labeling of the molecules of interest. Establishing new labels with enhanced photo-physical properties compared to frequently used labels is a major issue towards making the described methods more commonly available for investigations in live cells.

Developing and applying alternative fluorescent labels with enhanced photo-physical properties was an important aspect of this thesis. One approach to achieving this goal was to introduce nanodiamonds with fluorescent NV color centers as markers in live cells. Another currently uncommon labeling technique using ACP-tags was used to investigate protein complexes at the plasma membrane of live cells. This technique offers a specific label for proteins. Synthetic fluorescent chromophores with superior photo-physical properties can bind to ACP-tags with high specificity. The significant enhancement in the signal to noise ratio allows detecting single receptors in living cells by spectroscopic means. The following paragraphs present the most important results of this work.

The application of the methods of single-molecule spectroscopy presented in this thesis, offers new approaches to problems of cell biology that were inaccessible by currently established methods. During the past years these methods have been incorporated into commercial systems, or such a development is in progress. Hence, one can expect an increasing propagation of single molecule techniques in biology and medicine in the near future.