Entwicklung von Werkzeugen zur Darstellung und Durchmusterung von Proteinbibliotheken

Abstract

Die Zufallsmutagenese etabliert sich zunehmend als Methode zur Veränderung von Proteineigenschaften. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden zur automatisierten Erstellung und Durchmusterung von so erzeugten Proteinbibliotheken beschrieben. Um die Durchmusterung der Bibliotheken mit Roboterunterstützung durchführen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Vereinzelung der Mutanten in Mikrotiterplatten erlaubt. Zu diesem Zweck wurde ein Vektor konstruiert, welcher neben dem mutierten Gen noch das green fluorescent Protein (gfp) trägt. Mit diesem Vektor transformierte E. coli konnten bereits 3 Stunden nach Transformation mittels eines Zellsorters detektiert und in Kompartimente einer Mikrotiterplatte abgelegt werden, wo sie identisches Wachstums- und Expressionsverhalten zeigten. Für den Nachweis von Epoxidhydrolase-Aktivität wurde ein Assay auf Basis von p-(4-Nitrobenzyl)-pyridin entwickelt. Der Test wurde im robotergestützten Hochdurchsatzscreening einer Streptomyceten-Stammsammlung validiert. Es gelang damit allerdings nicht in einer durch rationale und Zufallsmutagenese erzeugten Proteinbibliothek einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus Epoxidhydrolase-Aktivität nachzuweisen. Ebenfalls durch Zufallsmutagenese wurden neue Peptide für die Metallaffinitätschromatografie entwickelt. Ausgehend von einer bekannten Metallbindungsstelle einer ATPase aus Helicobacter pylori wurde das Sequenzmotiv HxHxxxCxxC mittels wobble Primer Technik variiert und an das gfp fusioniert. Die so entstandene Proteinbibliothek wurde mittels eines Laborroboters in Mikrotiterplatten auf die Bindungseigenschaften an Metallaffinitätsmatrizen untersucht. Es wurden Affinitätspeptide mit gegenüber dem (His)6-Tag deutlich verbesserten Eigenschaften gefunden. Die breite Anwendbarkeit des Affinitätspeptids konnte am Beispiel der Aufreinigung einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus, die sowohl in E. coli als auch in Streptomyces lividans exprimiert wurde, gezeigt werden.

Random mutagenesis is becoming a more and more powerful tool for the improvement of protein properties. In this thesis new methods for the automated preparation and screening of protein libraries are shown. Using robot assisted screening techniques, it is necessary to singularize the mutants in discrete wells of the microtiter plate. This was achieved by using a vector bearing the green fluorescent protein (gfp) and the mutated gene. Three hours after transformation, the transformants could be detected and separated in single wells of a microtiterplate by a flow cytometer. It could be shown, that the growing and expression properties in each well were identical. For the detection of epoxide hydrolase activity a assay based on p-(4-Nitrobenzyl)-pyridin was developed. The assay was validated by screening a Streptomyces strain collection. However no epoxide hydrolase activity could be detected in a protein library of a lipase from Bacillus thermocatenulatus, obtained by rational and random mutagenesis. Random mutagenesis and roboter assisted screening was also used for developing new peptides for use in immobilised metal affinity chromatography (IMAC). For this purpose, a known metal binding sequenze (HxHxxxCxxC) from an ATPase of Helicobacter pylori was mutagenised using wobble primer techniques. The tag peptides were fused to the gfp, the peptide library obtained was tested for changed binding properties to the IMAC matrix using microtiterplates and a robot system. Metal affinity peptides with improved properties compared to the (His)6-tag were found. The broad application range of the new peptides found were proven by fusion to a lipase from Bacillus thermocatenulatus, which was expressed in E. coli or Streptomyces lividans. It was also possible to cleave the tag by introducing a Xa protease cleaving site.