Erstellung einer Enzymbibliothek über gerichtete Evolution, Entwicklung von Assaysystemen zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken auf Epoxidhydrolaseaktivität, Aufreinigung einer Epoxidhydrolase aus Streptomyces antibioticus

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht durch Methoden der zielgerichteten Mutagenese und der gerichteten Evolution aus einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens und einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus eine Enzymvariante mit Epoxidhydrolaseaktivität zu erhalten. Um die katalytische Traide der Epoxidhydrolasen nachzuahmen wurde in beiden Enzymen das Serin im aktiven Zentrum gegen Asparaginsäure ausgetauscht und Mutationen über error-prone PCR eingeführt. Die Varianten wurden vereinzelt, die Bakterien in Mikrotiterplatten kultiviert und die Enzymvarianten exprimiert. Hierzu war die Entwicklung eines Assay notwendig. Als Assaysubstanzen fanden mit Chromophoren substituierte Epoxycarbonsäureester Verwendung. Dabei konnte bei diesen Varianten keine Epoxidhydrolaseaktivität nachgewiesen werden. Zum direkten Nachweis der Epoxidhydrolyse wurde ein Assay basierend auf der Reaktion von 4-(4´-Nitrobenyl)-pyridin mit einem Epoxid in Mikrotiterplatte entwickelt. Durch den Einsatz eines Lösungsvermittlers und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte die Epoxidhydrolyse in Gegenwart von ganzen Mikroorganismen oder Rohextrakt nachgewiesen werden. Dabei konnten in den erzeugten Enzymbibliotheken keine Epoxidhydrolase gefunden werden, allerdings konnte innerhalb der Gattung der Streptomyceten Epoxidhydrolasen identifiziert werden. Der Stamm mit der höchsten Epoxidhydrolaseaktivität (S. antibioticus Tü4) wurde fermentiert und die Epoxidhydrolase teilweise aufgereinigt. Verschiedene Epoxide (Styroloxid, 1,2-Decanoxid und 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester) wurden ganzen Zellen oder der angereinigten Epoxidhydrolase umgesetzt und die Umsetzungen gaschromatographisch verfolgt. Die Stabilität der Epoxidhydrolase in Gegenwart verschiedener Cosolventien wurde untersucht. Der Stamm zeigte eine hohe Aktivität gegenüber 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester und eine moderate Enantioselektivität (E=13) bei der Racematspaltung von Styroloxid.

In the present work, the directed evolution of an esterase from Pseudomonas fluorescens and of an lipase from Bacillus thermocatenulatus towards an epoxide hydrolase was attempted. Starting from a rational mutagenesis by changing the serine from the catalytic triad to an aspartate, random mutagenesis was performed via error-prone PCR. The mutants were singularized, the bacteria were grown in microtiter plates and the mutated enzymes were expressed. Based on the substrate specificity of the wild type enzyme, the development of an assay was necessary. As assay substances, different 4-pentene- and 4,5-epoxypentane-carboxylicesters were used besides dodecenoic- and 4,5-epoxydodecanoicesters from different chromophoric alcohols. No epoxide hydrolase could be detected. For the direct measurement of epoxide depletion, an assay using 4-(4´-nitrobenzyl)-pyridine was developed in microtiterplates. By the use of a cosolvent and optimization of the reaction conditions, the assay could be performed in the presence of whole microorganisms and crude cell extract without extraction with an organic solvent and under mild incubation conditions. No epoxide hydrolysis could be detected via the directed evolution experiments, but for the first time epoxide hydrolases could be found in the Streptomyces family. The strain with the highest epoxide hydrolase activity S. antibioticus Tü4 was cultivated in a 30 L fermenter and the epoxide hydrolase was partially purified. Biotransformations using different epoxides (styrene oxide, 1,2-decane oxide and 3-phenyl ethylglycidate) were done using whole cells and partially purified epoxide hydrolase. The stability towards the addition of cosolvents to the reaction mixture was investigated. The strains shows a high activity towards 3-phenyl-ethyl-glycidate and a moderate enantioselectivity (E=13) in the kinetic resolution of styrene oxide.