Die Lipase aus Rhizopus oryzae: Klonierung, Expression, Reinigung und Mutagenese eines industriell relevanten Enzyms für die Biokatalyse und die Strukturbestimmung

Abstract

Die Lipase aus Rhizopus oryzae (ROL) konnte in der Vergangenheit in E. coli erfolgreich in Form inaktiver Einschlußverbindungen exprimiert werden. Um daraus die aktive Lipase zu erhalten, musste diese durch eine teure und aufwendige Rückfaltungsprozedur renaturiert werden. Da die Hefe Pichia pastoris dafür bekannt ist, heterologe Proteine mit großen Ausbeuten zu exprimieren wurde sie zur Produktion der reifen ROL, sowie diverser Mutanten verwendet. Die Expression unter Kontrolle des methanol-induzierbaren Alkoholoxidase Promotors (AOX1) ergab wesentlich höhere Ausbeuten wie unter dem konstitutiv exprimierenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Promotor (GAP). Er stellte deshalb für weitere Arbeiten den Promotor der Wahl dar. Es folgten eine Reihe fermenatativer Studien in komplexem Vollmedium, wie auch in synthetischem Medium zur Erhöhung der Lipase Ausbeute. Dabei konnten sowohl der Sauerstoffeintrag, wie auch die Fütterungsrate als Schlüsselparameter bei der Ausbeute identifiziert werden. In einem optimierten Fermentationsprotokoll konnte die sechsfache Menge aktiver Lipase, verglichen mit Escherichia coli erreicht werden. Die Lipase aus den verschiedenen Kultivierungen in komplexem Medium konnte durch einen Konzentrierungs- und einen Chromatographieschritt bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Die ROL aus Pichia pastoris wurde biochemisch charakterisiert und die Eigenschaften mit denen der ROL aus Escherichia coli verglichen. Abgesehen von der erhöhten Thermostabilität der ROL aus P. pastoris verhielten sich die Enzyme aus beiden Expressionssystemen sehr ähnlich. Außerdem konnte eine Klasse von zufällig erzeugten Fusionspeptiden ausgehend von der Metallbindungsstelle der ATPase 439 von Helicobacter pylori zur Verwendung in der Metallafinitätschromatographie entwickelt werden. Durch High-Throughput Screening konnte ein Peptid identifiziert werden, welches gegenüber dem His-Tag verbesserte Eigenschaften aufwies.

The mature active lipase and some mutants of Rhizopus oryzae (ROL) were successfully expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The production of this lipase in Escherichia coli lead to inactive inclusion bodies, which required a cumbersome and expensive refolding procedure. The expression levels using the inducible alcohol oxidase promotor (AOX1) and the constitutive glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) were investigated showing higher levels for the AOX promotor system. Fusion of the lipase to the alpha-factor of Saccharomyces cerevisiae allowed the secretion into the medium simplifying the purification. Furthermore, extensive fermentation studies in complex and synthetic medium to enhance the lipase production were performed. The dissolved oxygen content as well as the methanol feeding rate turned out to be key factors for an enhanced lipase yield. The ROL was purified in a single-step ion-exchange chromatography after concentration of the supernatant by diafiltration. Thus, a six fold amount of pure active lipase compared to Escherichia coli could be obtained. The purified lipase was characterized biochemically and compared to ROL expressed in Escherichia coli. No significant differences in the properties between recombinant lipase from the two expression systems could be found, except for the better thermal stability of the ROL from Pichia pastoris. Additionally, a new purification procedure for metal affinity chromatography was investigated. The metal binding site of the ATPase 439 of Helicobacter pylori was modified using random mutagenesis to develop a toolbox of fusion peptides for the purpose of metal affinity chromatography. After high-throughput screening a new Tag (HeliTag) could be found delivering a better performance compared to the His-Tag.