Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.

The aim of this work was the selective conversion of α- and/or β-ionone to 3-hydroxy ionones by microbial transformation. These 3-hydroxy ionones could supply valuable intermediates for the chemoenzymatic synthesis of astaxanthin and zeaxanthin. More than 200 Streptomyces strains were screened for their capacity to regio- and stereoselectively hydroxylate β- and/or α-ionone to the respective 3-hydroxy derivatives. With β-ionone as the substrate, 19 strains showed conversion to 4-hydroxy- and none showed conversion to the 3-hydroxy-β-ionone as desired. Among these 19 strains six converted α-ionone to 3-hydroxy-α-ionone. S. fradiae Tü 27 showed the highest hydroxylation activity (75). GLC and NMR analyses clearly established that hydroxylation of racemic α-ionone [(6R)-(-)/(6S)-(+)] resulted in the exclusive formation of only the two enantiomers (3R,6R)- and (3S,6S)-hydroxy-α-ionone. Thus, the enzymatic hydroxylation of α-ionone by the Streptomyces strains tested proceeds with both high regio- and stereoselectivity. For the isolation of the gene encoding oforthis hydroxylation enzyme, P450 gene fragments of three strains were amplified and sequenced. Two gene fragments from S. fradiae Tü 27 were identified but the isolation of the whole gene by different methods did not succeed. The two P450 homologous genes of the strain S. fradiae Tü 27 were interrupted by integrationmutagenesis, to identify the P450 gene fragment encoding for the hydroxylase which is responsible for the selective hydroxylation of α-ionone. With these mutants the biotransformation of α-ionone was tested. Whereas the mutant GMP450-27Q was capable to convert α-ionone to 3-hydroxy-α-ionone, although with by-product, the mutant GMP450-27P α-ionone could not selectively convert α-ionone to 3-hydroxy-α-ionone. Therefore, P450-27P seems to be responsible for the selective hydroxylation of α-ionone.