Overexpression and protein engineering of lipase A and B from Geotrichum candidum CMICC335426

Abstract

Im wachsenden Interesse an Produkten mit geringerem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt die Bedeutung der Lipase B von Geotrichum candidum, die eine hohe Spezifität für Fettsäureester von cis-D9 ungesättigten Verbindungen zeigt. Die Lipase B und die hochhomologe Lipase A aus Geotrichum candidum wurden erfolgreich in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, mit einer Ausbeute von 6-8 U/(ml Medium). Die Lipasen wurden funktionell und in hoher Ausbeute auch in Pichia pastoris exprimiert. Da ausschließlich die rekombinanten Proteine von dieser Hefe sekretiert werden, liegen die Proteine bereits in nahezu reiner Form im Medium vor. Die Fermentationen der rekombinanten Lipase B wurden unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Das beste Ergebnis (600.000 U/l Kultur der reinen Lipase B) wurde in einer Hochzelldichtefermentation in billigerem synthetischem Medium erzielt. Die rekombinanten Lipasen A und B wurden hinsichtlich Substratspezifität, Temperatur- und pH-Einfluß charakterisiert. Diese Eigenschaften sind ähnlich wie die der nativen Lipasen A und B von Geotrichum candidum. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B. Dazu wurden Zufallsmutagenese, Punktgerichtete-Mutagenese und Immobilisierung durchgeführt. Durch Zufallsmutagenese und Punktgerichtete-Mutagenese konnten keine Mutanten mit erhöhter Thermostabilität identifiziert werden, während die Immobilisierung auf jeder der verwendeten Matrixen zur Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B führte. Die Halbwertszeit des Enzyms bei einer Temperatur von 50 °C konnte von 30 Minuten für die gelöste Lipase auf bis zu mehreren Stunden für die immobilisierte gesteigert werden. Die Überexpression der Lipase B in Pichia pastoris ermöglicht zusammen mit der entwickelten Immobilisierungsmethode eine billige Nutzung des Enzyms in industriellem Maßstab, beispielsweise zur Modifikation der Zusammensetzung von Ölen.

The lipase B from Geotrichum candidum, interesting for its peculiar specificity for substrates with a cis-D9 insaturation, and its isoenzyme lipase A were successfully expressed in Saccharomyces cerevisiae. The transformants expressed and secreted the lipases at low levels (6-8 U/ml after 2 days of culture). The lipase genes were also cloned in a vector suitable for expression in the yeast Pichia pastoris. In this expression system, the proteins were functionally expressed and secreted in the culture medium at high levels (50 U/ml after 2 days of culture). The protein of interest was almost the only protein secreted into the medium by Pichia pastoris, thus it was already obtained pure. Fermentations of the Pichia pastoris clone producing lipase B were carried out using different media and in a synthetic medium nearly 600.000 U of pure lipase per liter were reached. The recombinant lipase B was characterised in terms of substrate specificity, pH and temperature stability, activity at different pH values and temperatures. The investigated enzyme properties were comparable to those reported for the native enzyme. To increase the thermostability of lipase B from Geotrichum candidum three different approaches were used: random mutagenesis, site-directed mutagenesis and protein immobilization. With the random- and site-directed mutagenesis approach no mutants with increased thermostability could be identified. Through immobilization on a polypropylene support the half life of the enzyme at 50 °C could be increased from 30 minutes for the soluble lipase to some hours for the immobilized. This work, due to the high expression levels in Pichia pastoris and increased thermostability by immobilization, raises the possibility to develop an industrial application of the specific lipase B from Geotrichum candidum in the modification of the fatty acids profile of oils.