Gensynthese, Expression und Refolding der Lipasen aus Pseudomonas species KWI 56 und Chromobacterium viscosum

Abstract

Pseudomonas-Lipasen finden breite industrielle Anwendung in Waschmitteln und in der organischen Synthese. Ihre Gewinnung erfolgte bisher durch Isolierung aus dem Wirtsorganismus oder durch homologe Expression in Pseudomonas. Da viele der verwendeten Pseudomonaden jedoch als potentiell pathogen gelten, sind spezielle Sicherheitsmaßnahmen bei ihrer Kultivierung erforderlich. Auch eignen sie sich nicht zum Proteindesign mit Hilfe evolutiver Strategien. Daher wurde in dieser Arbeit ein heterologes Expressionssystem in E. coli und ein In-vitro-Refolding für diese Lipasen etabliert. Die Gene für die Lipasen und deren zur korrekten Faltung erforderlichen Helferproteine wurden de novo synthetisiert. Beim Design der Gene wurde der GC-Gehalt verringert, die Codon-Usage für E. coli optimiert und die Gene durch Einführung singulärer Restriktionsschnittstellen in Module aufgeteilt. Zur Expression wurden die Gene in verschiedene Vektoren kloniert. Hohe Expressionsraten (50 % des Gesamtzellproteins) der Lipasen konnten unter der Kontrolle des T7-Promotors im Plasmid pET20b(+) erreicht werden, allerdings liegt die Lipase inaktiv in E. coli vor. Eine Expression der Helferproteine in E. coli war erst nach Entfernung stark hydrophober N-terminaler Seqenzen zu erreichen. Unter Einsatz der rekombinanten Helferproteine wurde ein schnelles und effizientes In-vitro-Refolding zur Aktivierung der rekombinanten Lipasen entwickelt. Das Refolding resultiert in Ausbeuten von 310 000 U/g Zellen für die rekombinante Lipase aus Pseudomonas species KWI 56 und 200 000 U/g Zellen für die rekombinante Lipase aus Chromobacterium viscosum. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, daß beide Lipasen mit Hilfe der Helferproteine verwandter Lipasen ebenso effizient rückgefaltet werden können.

Pseudomonas lipases are industrially used as detergent additives, in food industry and in organic synthesis. At present, these lipases are either directly isolated from wild-type strains or overexpressed in recombinant Pseudomonas host strains, which may be subject to special safety regulations and are unsuitable for enzyme engineering via directed evolution. Therefore, a heterologous expression of two Pseudomonas lipases in E. coli was developped in this work. The genes for the lipases of Pseudomonas sp. KWI 56 and Chromobacterium viscosum and their specific chaperones required for correct folding were completely synthesized with an optimized nucleotide sequence in terms of heterologous expression in E. coli and simplified genetic manipulations. Lipases and truncated chaperones were overexpressed (up to 50 %) in E. coli. However, both lipases were expressed inactively in inclusion bodies. Quantitative in vitro refolding of the lipases in the presence of their specific chaperones yielded 310 000 U/g wet cells for the lipase from Pseudomonas sp. KWI 56 expressed in E. coli and 190 000 U/g wet cells for the recombinant expressed lipase from Chromobacterium viscosum. Furthermore, it was found, that these lipases can also be efficiently refolded in the presence of chaperones of related lipases.