Untersuchungen zur Stabilisierung von Membranproteinen mit ungewöhnlichen Phospholipiden

Abstract

Phospholipide, eine wichtige Lipidklasse, haben eine Vielzahl biologischer Funktionen. Daher stieg ihre Bedeutung für eine Anwendung auf dem Gebiet der Pharmazie und Kosmetik. Da die de novo Synthese von Phospholipiden schwierig ist, ist ihre Wirkungsweise in Membranprozessen hauptsächlich mit Eigelbextrakten und Bakterienkulturen untersucht worden. In vorangegangenen Arbeiten, die sich mit der Anwendung von Phospholipiden für die Stabilisierung von Membranproteinen beschäftigten, wurden eine Reihe von isomeren Phosphatidylcholinen synthetisiert, die acetylenische Fettsäuren tragen und einen Tm- Wert im Bereich physiologischer Temperaturen haben. Da biologische Membranen aus Phospholipiden unterschiedlicher Kopfgruppen bestehen, wurden über Kopfgruppenaustausch mit Phospholipase D mit vier neue Gruppen acetylenischer Phospholipide - Ethanolamin, L-Serin, Glycerol und Phosphatidat – erhalten. Diese Verbindungen wurden physikochemisch (DSC, FT-IR und Röntgenbeugung) charakterisiert. Ein großer Vorteil dieser acetylenischen Phospholipide ist ihr um ca. 30 °C niedriger Tm-Wert im Vergleich zu dem entsprechenden gesättigten Phospholipid. Jedoch war bisher nicht bekannt, welchen Einfluß die ungewöhnlichen Phospholipide auf die Aktivität und Stabilität von integralen Membranproteinen ausüben. Der Einfluß der acetylenischen Phospholipide auf die Aktivität einer mitochondrialen P450-Monooxygenase des steroidogenen Stoffwechsels - P450SCC (CYP11A1) - war daher Gegenstand der Untersuchung. Dabei wurde eine geeignete Technik zur Herstellung von Liposomen mit einem Durchmesser von 100 nm entwickelt, wobei die Grössenverteilung der Liposomen durch Lichtstreuung ermittelt wurde. Es ergaben sich Gesetzmäßigkeiten im Bereich der Acylketten hinsichtlich der Lage der Dreifachbindung. Gleichzeitig wurde ein signifikanter Einfluß der verschieden Kopfgruppen beobachtet.

Phospholipids, a major lipid class, exhibit a variety of biological functions. They thus became a subject for pharmaceutical and cosmetical application. Because the de novo synthesis of phospholipids is a complicated task, their function in membrane processes has predominantly been investigated with preparations from e.g. egg yolk extractions or bacteria cultures. In our ongoing program on the application of phospholipids in the stabilization of membrane proteins, we synthesized a range of phosphatidylcholines bearing acetylenic fatty acids which had Tm- values close to physiological temperatures. In order to mimic biological membranes, a range of different phospholipids with the head groups ethanolamine, L-serine, glycerol and phosphatidate was synthesized through transphosphatidylation using phospholipase D from Streptomyces antibioticus. This substances were charakterized physicochemically (DSC, FT-IR, Y-Ray). The advantage of these acetylenic phospholipids is their Tm-value, which was lowered about 30 °C compared to the saturated analogs. The influence of this unusual phospholipids on the activity and stability of membrane proteins was investigated with the monooxygenase CYP 11A1 (P450SCC) as model enzyme. A technique for the production of liposomes with a diameter of 100 nm was developed and the size distribution of the vesicles was checked by light scattering. The activity of P450SCC was stimulated depending on the position of the triple bond in the acyl chains and the nature of the head groups.