Biochemische Nachweisverfahren auf der Basis genetischer Regulationselemente: vom Reporterassay zum Repressor/DNA-Bindungstest

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Grundlage von genetischen Regulationselementen ein in vivo Assay und vergleichend hierzu ein in vitro Assay entwickelt. Ein rekombinanter E. coli Stamm wurde beim in vivo Reporterassay zur Detektion von 4-CBA verwendet, der bei Anwesenheit von 4-CBA Luziferase exprimiert. Durch Immobilisierung dieses Stammes konnte ein einfaches und spezifisches Testverfahren im Mikrotiterplattenformat entwickelt werden. Mit den optimierten Immobilisierungsbedingungen und der Verwendung einer Membranmutante von E. coli konnte ein Detektionslimit von 28 µM 4-CBA in 200 min erreicht werden. Zusätzlich wurde ein von den Eigenschaften der Zelle unabhängiges in vitro Assaysystem entwickelt. Da der Mechanismus der Tetrazyklinresistenz in Bakterien bekannt war, wurde Tetrazyklin als Analyt ausgewählt. Im neu zu entwickelnden Assay sollte der durch Tetrazyklin induzierte Abfall des Repressors von der Operator DNA zur quantitativen Bestimmung von Tetrazyklin benutzt werden. Dazu wurde der Tet Repressor mit N-terminal oder C-terminal fusioniertem Tag und nativ in E. coli überexprimiert. Die Funktionalität der Repressoren wurde im Gel-Mobility-Shift Assay untersucht. Nur der Repressor ohne Tag sowie der Repressor mit einem durch Proteaseverdau abgespaltenem Tag zeigten volle biologische Aktivität. Im Hinblick auf eine spätere Assay-Entwicklung wurde der Einfluß eines enzymatischen Markers auf die Repressor/Operator-DNA-Bindung mit derselben Methode getestet. Daraus folgte eine Versuchsdurchführung für den Mikrotiterplatten-Assay. Diese beeinhaltete die Immobilisierung des Repressors, die Bindung von Tetrazyklin an diesen und die Bindung POD markierter Operator-DNA an tetrazyklinfreie Repressoren. Die Bestimmung der POD Aktivität ließ Rückschlüsse auf die vorhandene Tetrazyklinkonzentration zu. Da dieses Assayformat mit sehr großen Standardabweichungen verbunden war, wurden markerfreie Oberflächenplasmonresonanzmessungen vorgenommen.

The aim of this study was the development of in vivo and in vitro test systems using genetic regulatory elements. The in vivo reporter assay detected 4-CBA with recombinant E. coli strains. These strains express luciferase in the presence of 4-CBA, which can be quantified by its enzymatic reaction. Immobilization of the microorganism provided a handy and specific microtiter plate assay. The optimized system had a detection limit of 4-CBA of 28 µM within 200 min using a membrane mutant strain of E. coli. The second objective was the development of a cell independent in vitro system. The development was based on the mechanism responsible for the tetracycline resistance in microorganisms using it for the detection of tetracycline. Tetracycline induces by its binding to the Tet repressor dissociation of the repressor from the operator. The assay was to use the release of the repressor from the operator by tetracycline to quantify the analyte. The Tet repressor was overexpressed in E. coli either without any tag or as N-terminal or C-terminal fusion to Streptag(II). The activity of these repressors was checked in gel-mobility-shift assays. All three obtained repressors could bind to the operator, but only the repressor without tag and the repressor with protease digested tag showed dissociation from the DNA after tetracycline addition. In light of the later assay development the influence of an enzymatic label at the end of the operator DNA fragment onto the binding of the repressor was studied as well using a gel-mobility-shift assay. Based on these results a microtiter plate format assay was tested. After immobilization of the repressor binding studies on enzymatic labeled operator DNA were performed. Using POD activity estimation of the tetracycline concentration was possible. Due to the high standard deviations later surface plasmon resonance was used to measure the binding capability of the label free operator DNA fragments.