DNA-Array-Technologie für transkriptionelle Untersuchungen des Genoms der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

DNA-Array-Technologie ermöglicht die hoch-parallele Untersuchung transkriptioneller Aktivität. Sie wurde am vollständigen Gensatz von Saccharomyces cerevisiae methodisch etabliert und angewendet. Hierfür wurden 6116 offene Leserahmen der Hefe mittels PCR isoliert und auf Membranen aufgebracht. Auf diese wurden revers transkribierte Proben hybridisiert, die die Gesamt-mRNA aus Hefezellen repräsentierten. Die Signalintensität an jeder Belegposition des Rasters dient als Maß für die relative Häufigkeit des entsprechenden Transkripts. Die Methodik wurde bezüglich ihrer Aussagekraft bewertet und kontinuierlich technisch weiter entwickelt. Systematische Variation der Hybridisierungsparameter, speziell für die immobilisierte und freie DNA, schuf die Grundlage für eine Quantifizierung der absoluten Transkripthäufigkeiten. Die gewonnenen Rohdaten wurden mit Hilfe mathematischer Routinen prozessiert und neue Visualisierungs- und Analyseverfahren wurden auf die nach Signifikanz und anderen Kriterien gefilterten Datensätze angewendet, um eine biologische Interpretation zu unterstützen. Aus eigenen Experimenten und zahlreichen Kooperationen wurden beispielhaft die Ergebnisse aus vier experimentellen Ansätzen vorgestellt: (1) Vergleich einer industriell genutzten Weinhefe mit einem Laborstamm, sowohl auf transkriptioneller als auch genomischer Ebene. (2) Untersuchungen einer Disruptionsmutante im Gen des tRNA-Export-Faktors Los1p. (3) Erhöhung der Wachstumstemperatur von 30°C auf 37°C. (4) Adaptation von Hefezellen an hohe externe Salzkonzentration.

DNA-array-technology can be used to investigate transcriptional activity in a highly parallel manner. This methodology was set up and performed to monitor transcript levels of virtually all genes of Saccharomyces cerevisiae. 6116 open reading frames of the yeast were PCR amplified and arrayed in duplicate and at high densities onto membranes. Total RNA from yeasts of different genotypes or growth conditions was isolated, labelled during reverse transcription and hybridised onto these arrays. Signal intensities at each position were quantified and relative changes in transcript levels were measured. Significant effort has been put into the quality assessment and the performance of the technology has been improved continuously. Raw data were processed by mathematical routines and filtered for significance and other criteria. New procedures for the analysis and visualisation were applied to these high-level data in order to help for biological interpretation. By systematic variation of the hybridisation parameters, particularly for the immobilised and free DNA, the fundamental tools towards the absolute quantification of transcript levels were developed. The technology was applied to a wide range of experimental conditions in own experiments and numerous co-operations and the results of four experimental set-ups were presented exemplarily: (1) an industrial wine yeast strain was compared to a standard laboratory strain both for transcriptional and genomic differences. (2) The investigation of a mutant strain, disrupted in the gene for the tRNA-export-factor Los1p. (3) Increasing the growth temperature from 30°C to 37°C. (4) The adaptation of yeast cultures to high external salt concentrations.