Strukturelle Untersuchungen an Atrazin- und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure-spezifischen Antikörperfragmenten mittels molecular modelling und ortspezifischer Mutagenese

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Bindungseigenschaften eines Atrazin-spezifischen Fab-Fragments K411B und eines 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D)-spezifischen Fab-Fragments Fab24D mittels molecular modelling und ortspezifischer Mutagenese untersucht. Auf der Grundlage der Sequenzhomologie mit bekannten Antikörperstrukturen und durch die Identifizierung der kanonischen Strukturklassen der CDR wurde jeweils ein Strukturmodell für das variable Fragment des Antikörpers entwickelt. Die Identifizierung der für die Bindung des Haptens verantwortlichen Aminosäurereste erfolgte mittels molekülmechanischen und -dynamischen Methoden und unter Verwendung des Kreuzreaktivitätsmusters des jeweiligen Antikörpers. Durch Mutationen bestimmter Aminosäurereste in der Bindungsstelle des jeweiligen Antikörpers konnten die Zuverlässigkeit der Strukturmodelle bestätigt werden. Im Falle des Atrazin-spezifischen Fab-Fragments K411B konnte eine fünffach höhere Affinität durch die Kombination der Punktmutationen GlnL89Glu, ValH37Ile und GluL3Val erreicht werden, wie die Messung mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz mit BIAcore ergab. Die höhere Affinität führte im direkten kompetitiven ELISA für Atrazin jedoch nicht zur Verbesserung der Sensitivität. Durch die Ausnutzung der Erhöhung der Affinität und der geringen Kreuzreaktivität der Mutanten zum Hapten 4-Amino-6-chloro-1,3,5-triazin-2-(6-aminohexansäure) konnte eine achtfache Verbesserung der Sensitivität des Atrazin-ELISAs erzielt werden. Die Reduzierung der Spacererkennung durch die Mutationen PheL32Leu und GlnL89Glu führte zu einer dreifachen Verbesserung der Sensitivität des Atrazin-ELISAs. Im Falle des 2,4-D-spezifischen Fab-Fragments ergaben die Mutationen HisL34Phe und HisL34Tyr eine Veränderung der Spezifität von 2,4-D nach 2,4,5-T, die jedoch mit einer deutlichen Abnahme der Affinität verbunden war.

In this study, the binding properties of an atrazine specific Fab fragment K411B and a 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D)-specific Fab fragment Fab24D were investigated by means of molecular modelling and site-directed mutagenesis. Based on the homology to antibodies of known structures and by the identification of canonical structure classes of the complementarity determining regions (CDRs), a structure model for each of the variable fragments of the antibodies was constructed. Molecular mechanics and dynamics as well as the cross-reactivity patterns of the respective antibodies were used to identify amino acid residues responsible for the binding of the hapten. The reliability of the models was scrutinized by mutations of amino acid residues in the binding site of the respective antibodies. In the case of the Fab-fragment K411B, a five-fold improvement in affinity due to a combination of point mutations GlnL89Glu, ValH37Ile and GluL3Val could be obtained, as indicated by surface plasmone resonance (SPR) measurement using BIAcore. However, the increased affinity did not lead to an improvement in sensitivity of a direct competitive ELISA for the determination of atrazine. An eight-fold improvement in sensitivity of a direct competitive ELISA for atrazine could be achieved by taking advantage of the increased affinity and the low cross-reactivity of the mutant towards the hapten 6-{[4-amino-6-chloro-1,2,3-triazin-2-yl]aminohexanoic acid. Decreasing the spacer recognition due to the mutations PheL32Leu and GlnL89Glu led to a three-fold improvement in sensitivity of a direct competitive atrazine-ELISA. In the case of the Fab-fragment Fab24D, a change in specificity from 2,4-D to 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) could be achieved by either the mutation HisL34Phe or HisL34Tyr. However, the change in specificity led to a decrease in affinity towards 2,4,5-T.