Das Photoreaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides als Modellmembranprotein zur Reinigung, Rekonstitution in Liposomen aus ungewöhnlichen Phospholipiden, Charakterisierung und heterologen Expression

Abstract

Seit über 30 Jahren werden Liposomen als Modellsysteme für komplexe Zellmembranen eingesetzt. Sie bringen Einblicke in verschiedene Aspekte der Zellphysiologie und können zur Aufklärung von Strukturen, Dynamiken und Funktionen biologischer Membranen beitragen. Bisher wurden zumeist gewöhnliche Phospholipide zur Liposomen- und Proteoliposomenpräparation sowie zu ihrer anschließenden Charakterisierung verwendet. In dieser Arbeit wurden dagegen erstmals Modellsysteme mit ungewöhnlichen, acetylenischen Phospholipiden, die einen Tm-Wert im physiologischen Temperaturbereich aufwiesen, studiert. Mit diesen (1,2)-Diacyl-phosphatidyllipiden isomerer Octadecinsäuren, die unterschiedliche Kopfgruppen (Ethanolamin, L-Serin, Glycerol, Cholin, Phosphatidat) trugen, konnten Liposomen und Proteoliposomen präpariert und anschließend ihre Teilchengröße, Homogenität und Detergenzstabilität definiert werden. Für die Proteoliposomenpräparation wurde als Membranprotein das bakterielle Photoreaktionszentrum (RC) aus Rhodobacter sphaeroides gewählt. Dieses ist bereits umfangreich molekularbiologisch, photochemisch und biochemisch charakterisiert, und seine dreidimensionale Struktur ist bekannt. Auch wurde das RC schon mehrfach für Rekonstitutionen in Liposomen angewendet. Vor der Rekonstitution erfolgte die Isolierung und Reinigung des aktiven, integralen Membranproteins unter Verwendung von Detergenzien. Hierbei zeigten erstmals synthetische Zuckerester wie 6-O-Octanoyl-b-glucose und 6-O-Octanoyl-b-mannose gute solubilisierende Eigenschaften für RC. Unter Verwendung dieser Zuckerester wurde auch eine neue Liposomenpräparationsmethode etabliert. Dabei wurden in Gegenwart von Phospholipiden und Proteinen die Zuckerester von einer Monoglycerid-Lipase aus Bacillus species lipolytisch gespalten und es wurden spontan Liposomen gebildet. Proteoliposomen, die aus PG und PS präpariert wurden, zeigten eine deutliche Orientierung des RCs.

As a relatively simple replacement for large biological membranes, liposomes have been used extensively in basic research as well as in technical applications (e.g. drug transport) during the past 30 years. Typically, liposomes made up of natural lipids are used. In this work the application of novel phospholipids containing unusual fatty acids for liposome preparation, protein reconstitution and further investigation of protein and liposome stability is described. These unusual phosphatidylcholines bearing fatty acids such as 14-octadecynoic acid and 4-octadecynoic acid have various head groups like choline (PC), glycerol (PG), ethanolamine (PE), L-serine (PS) and the free acid (PA). The synthesis of phospholipids started from the corresponding 1,2-di-(octadecanol)-sn-glycero-3-phosphocholines. For protein reconstitution the photoreaction center (RC) of Rhodobacter sphaeroides was applied. Before its reconstitution, the active membrane protein was isolated and purified by detergent mediated methods. For the first time synthetic sugar esters like 6-O-octanoyl-b-D-glucose and 6-O-octanoyl-b-D-mannose showed good solubilization properties for RC and were used for a new established liposome preparation method. In the presence of phospholipids and proteins, sugar esters were cleaved lipolytical by a monoglycerid lipase of Bacillus species and liposomes were build spontaneously. Proteoliposomes composed of negatively charged phospholipids like PG and PS showed orientation of RC.