The molecular function and regulation of formins in the yeast Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Struktur, der Funktion und der Regulation des Formins Bni1p in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Es wurde gezeigt, daß die hochkonservierte FH2 Domäne von Bni1p essentiell für dessen Funktion ist. Dabei zeigten Mutationen im N- und C-Terminus der FH2 Domäne unterschiedliche Phänotypen. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen, die die Rho1p-bindende Domäne im N-Terminus von Bni1p für die Lokalisierung des Proteins verantwortlich halten, zeigte sich, daß die schwach konservierte FH3 Domäne im N-Terminus von Bni1p für die Lokalisierung essentiell ist. Die gezielte Herstellung eines bni1 Mutantenalleles, das zwei Punktmutationen in der FH2 Domäne besitzt, bni1-FH2#1, ist temperatursensitiv, wenn es mit einer Deletion des zweiten Formins, Bnr1p, kombiniert wird. Die Untersuchung dieses Mutantenstammes, bni1-FH2#1bnr1D, demonstrierte, daß Formine für die Entstehung von Aktinkabeln, aber nicht für die Bildung und Funktion von Aktinpatches verantwortlich sind. Zusätzlich wurde gezeigt, daß die Überexprimierung eines Alleles von Bni1p, das eine C-terminale Deletion trägt, Bni1-FDDp, eine übermäßige Anzahl von Aktinkabeln hervorruft. Dies unterstützt die Teilnahme von Forminen an der Entstehung von Aktinkabeln. Im Gegensatz zu Cdc42p führte die Überexprimierung von Rho1p zur Supprimierung des temperatursensitiven Wachstumsdefekts von bni1-CT*1dyn1* Zellen. Dies weist darauf hin, daß die Funktion von Bni1p (s. oben, Aktinkabelentstehung) durch Rho1p reguliert wird, was sich auch auf die Funktion des Mikrotubuli-Zytoskeletts auswirkt. Die Charakterisierung eines rho1 Mutantenallels betätigte, daß Rho1p einen Effekt auf Aktinkabel hat. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Lokalisierung von Bni1p an den Stellen aktiven Zellwachstums von Rho1p abhängig ist.

In this work multiple questions regarding the structure, function, and regulation of the yeast formin Bni1p were addressed. The FH2 domain was demonstrated to be essential for Bni1p’s function, and it was shown that mutations in the N- and C-terminus of the FH2 domain display diverse phenotypes. Previous reports showed that the deletion of the N-terminus that contains the Rho1p-binding domain, resulted in a loss of Bni1p localization, which argues that this domain is critical. In this work the deletion of the mapped Rho1p-binding domain did not have an effect on the localization of Bni1p. However the reported N-terminal truncation used before deletes half of the loosely conserved FH3 domain, which was shown to be required for formin localization in fission yeast (Petersen, 1998). The results of this work support the requirement of the FH3 domain. The generation of a bni1 allele that contains two point mutations in the FH2 domain resulted in a useful tool when it was combined with a deletion of the second formin in yeast, bnr1*. A bni1-FH2#1bnr1* strain is temperature sensitive at 34ºC. The characterization of this conditional strain revealed that formins are required for the assembly of actin cables, and do not affect actin patch function. In addition a C-terminally truncated allele of BNI1, BNI1-F*D, was demonstrated to generate aberrant actin cables when overexpressed, which strengthens the role of formins in the formation of actin cables. Finally, the consequence of the interaction between Bni1p and the two GTPases, Rho1p and Cdc42p, was investigated. Rho1p, but not Cdc42p was involved in the suppression of the temperature sensitive growth defect of a bni1-CT*1dyn1* strain. This suggested that Bni1p’s actin function is regulated by Rho1p, and consequently affects the microtubule cytoskeleton. In fact the characterization of a rho1 mutant allele demonstrated that Rho1p affects actin cables, and it does so by localizing Bni1p to the sites of growth.