Erhöhung der mikrobiellen und molekularen Diversität von Carotinoiden

Abstract

Carotinoide sind meist gelbe bis rote Farbstoffe, die in der Natur weit verbreitet sind. Sie werden derzeit als Tierfutterzusatz, Nahrungsergänzungsmittel und für pharmazeutische und kosmetische Produkte eingesetzt. Jedoch ist das Angebot strukturell verschiedener Carotinoide für medizinische Zwecke gering, und nur eine begrenzte Anzahl von Carotinoiden ist chemisch herzustellen, aus natürlichen Quellen zu isolieren oder zu fermentieren. Zunächst wurde in dieser Arbeit versucht, die mikrobielle Diversität von Carotinoiden zu erhöhen, indem Genbanken aus Boden-DNA auf Carotinoidbildung gescreent wurden. Dazu wurden verschiedene, sich im Aufschlußprinzip unterscheidende Methoden zur Extraktion von DNA aus Bodenproben miteinander verglichen. Dabei sollte erreicht werden, daß DNA aus Actinomyceten von DNA aus Gram-negativen Mikroorganismen abgetrennt werden kann, da die Expression von Actinomyceten Genen in E. coli wie auch die Expression von Genen aus Gram-negativen Organismen in Actinomyceten aufgrund unterschiedlicher Promotoren und Codon-usage oft problematisch ist. Durch die Kombination der Methoden nach Zhou und Moré konnte dies erreicht werden. Darüber hinaus wurde für die nach Moré isolierte DNA ein direktes Reinigungsprotokoll etabliert, wodurch die DNA ohne vorherige Fällung direkt mit Silica aus dem Lysat isoliert und gereinigt werden kann. Die anschließende Klonierung der nach Zhou isolierten DNA wurde in E. coli Zellen durchgeführt, die die beiden Carotinoid Gene crtB und crtE aus Erwinia uredovora auf einem Plasmid enthielten. Diese Zellen bilden bereits das farblose Carotinoid Phytoin. Durch Komplementationsscreening sollten nun Klone identifiziert werden, die weitere Gene für die Carotinoid Biosynthese tragen und deren Genprodukte Phytoin als Substrat nutzen können. So wäre die Identifizierung über eine Gelb- oder Rotfärbung des entsprechenden Klons möglich. Beim Screening von 70 000 Klonen konnte keiner identifiziert werden, der eine Gelb- oder Rotfärbung aufwies. Um eventuell auftretende systematische Fehler auszuschließen, wurde der Bodenprobe zur Validierung der Methode 1 ml E. uredovora-Kultur (entsprechend 5,5 x 108 Zellen) zugegeben, aus der anschließend DNA isoliert und die Genbank erstellt wurde. Beim Komplementationsscreening wurden unter 7 000 gescreenten Klonen vier identifiziert, die eine Gelborangefärbung aufwiesen, die von der Bildung von b-Carotin herrührt. Diese b-Carotin-Bildung war darauf zurückzuführen, daß die beiden Gene crtI und crtY, die im Genom von E. uredovora benachbart liegen, kloniert worden waren. Dies führt bei Komplementation mit den beiden Genen crtE und crtB, die in E. coli vorgelegt worden waren, zur Biosynthese von b-Carotin. Zur Erhöhung der molekularen Diversität von Carotinoiden wurde zunächst durch DNA shuffling zweier homologer Gene, die für Spheroiden Monooxygenasen codieren, versucht, die Substratspezifität dahingehend zu verändern, daß als bevorzugtes Produkt Carotinoide entstehen, die eine möglichst hohe Anzahl an Ketogruppen tragen. Die beiden Spheroiden Monooxygenasen (crtA) aus Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides können die Carotinoide, die bei Expression der in E. coli vorgelegten Gene crtB, crtE und crtI-C14 (eine crtI-Mutante, die durch DNA shuffling zweier homologer crtI-Gene erzeugt worden war) gebildet werden, als Substrat nutzen und zu Oxo-Produkten umsetzen. Die Genprodukte von crtE, crtB und crtI-C14 führen in E. coli zur Bildung eines Gemisches aus Lycopin und 3,4,3´,4´-Tetradehydrolycopin was eine Pinkfärbung des entsprechenden Klons hervorruft. Bei den entsprechenden Oxo-Derivaten handelt es sich um unterschiedliche Produkte, da Klone, die die Gene crtB, crtE und crtI-C14 und den entsprechenden crtA-Wildtyp exprimieren, unterschiedliche Färbungen aufweisen. Es wurden 24 000 Klone der durch DNA shuffling erzeugten Mutantenbibliothek gescreent, wobei keiner im Vergleich zu den jeweiligen Wildtypen eine veränderte Färbung aufwies. In einem weiteren Ansatz wurde der Carotinoid Biosyntheseweg in E. coli durch die auf einem Plasmid codierten Gene crtB, crtE, crtI-C14 und crtY bis zum b-Carotin verlängert. Klone mit diesem Plasmid weisen eine Gelborangefärbung auf, die auf die Bildung von b-Carotin zurückzuführen ist. Die b-Carotin-Ketolase CrtO aus Synechocystis sp. PCC6803 (SYO) kann b-Carotin zu dem Ketocarotinoid Echinenon umsetzen. Durch Komplementationsscreening einer durch error-prone PCR erzeugten Mutantenbibliothek von SYO sollten Mutanten erzeugt werden, die zur Bildung von Canthaxanthin anstatt Echinenon führen. Diese sind durch eine veränderte Färbung bei visuellem Screening identifizierbar. In dieser Arbeit wurden 35 000 Klone gescreent, wobei keiner eine Farbänderung aufwies. Bei näherer Untersuchung zeigte sich allerdings, daß durch veränderte Kultivierungsbedingungen auch der SYO-Wildtyp in der Lage ist, Canthaxanthin als Hauptprodukt zu produzieren.

Carotenoids compose a widely distributed class of structurally and functionally diverse yellow, orange and red natural pigments. They are currently produced for the use as food colorants, nutrient supplements, for pharmaceutical and cosmetic purposes, and for animal feed. However, the availability of structurally diverse carotenoids is limited as only a restricted number of carotenoids can be isolated from natural sources, synthesized chemically or produced by fermentation. Subject of this work was the enhancement of the microbial diversity of carotenoids by screening soil DNA libraries for the production of carotenoids. The first step was the comparison of various methods for the isolation of DNA from soil, differing in the principle of cell disruption. The aim was the selective isolation of DNA from actinomycetes (or generally Gram-positive bacteria) and non-actinomycetes for cloning in different hosts as the expression of actinomycete genes in E. coli is often limited due to different promoters and codon-usage. By a combination of the two different DNA extraction methods according to Zhou and Moré it was possible to isolate DNA from Gram-negative bacteria in the first step and G + C-rich Gram-positive bacteria in the second step. The G +C-rich DNA isolated in the second step is suitable for cloning in Streptomyces. Moreover, the method according to Moré was optimized by direct silica purification of the isolated DNA without prior DNA precipitation with ethanol. Construction of the library was done by cloning DNA from soil isolated by the method of Zhou in pUC vectors and transformation in E. coli cells harbouring the carotenoid genes crtB and crtE from Erwinia uredovora. Expression of these genes leads to the formation of phytoene, the first and colourless carotenoid in the carotenoid pathway. Genes from soil DNA, whose gene products can use phytoene as substrate lead to a yellow to red coloration of the respective clones caused by the production of carotenoids. These were supposed to be identified by visual complementation screening. 70000 clones were screened but none of the clones showed a yellow or red pigmentation. As systematic errors could have occurred the method was validated. Therefore to 5 g of soil sample 1 ml of Erwinia uredovora culture (corresponding to 5,5 x 108 cells) was added. After extraction of DNA by the method of Zhou the library was prepared as described above and the clones were screened for coloration. Four out of 7000 clones showed a yellow-orange pigmentation caused by the production of b-carotene. b-carotene was produced because the cloned gene fragment contained the adjacent genes crtI and crtY from Erwinia uredovora. Complementation of these genes with the two genes crtE and crtB, resulted in the synthesis of b-carotene. The second subject of this work was the enhancement of the molecular diversity of carotenoids. By DNA shuffling of two homologous genes from Rhodobacter capsulatus (RCA) and Rhodobacter sphaeroides (RSA) coding for the spheroidene monooxygenase (crtA) the properties of the enzyme should be altered to produce a carotenoid with a maximum number of oxo-groups as main product. This would lead to a deep-red pigmentation of the corresponding clone. E. coli cells harbouring the genes crtE, crtB and crtI-C14 (a mutant of crtI derived from DNA shuffling of two homologous crtI genes from E. uredovora and E. herbicola) produce a mixture of lycopene and 3,4,3´,4´-tetradehydrolycopene. These carotenoids lead to a pink pigmentation of the corresponding E. coli clone and serve as substrate for crtA. Both enzymes convert these substrates to different oxo-products as the clones, transformed with the different crtA genes show a different coloration. The mutant library created by DNA shuffling consisted of 24000 clones but mainly due to the screening system no one of these showed a different coloration compared to clones carrying the wild type enzymes. In a further experiment the carotenoid pathway in E. coli was further extended by the additional cloning of crtY from E. uredovora into a vector carrying the genes coding for CrtB, CrtE and CrtI-C14. Cells containing this plasmid construct showed a yellow-orange pigmentation due to the production of b-carotene. b-carotene-ketolase (CrtO) from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 (SYO) can convert b-carotene to the orange keto-product echinenone and minor amounts of canthaxanthin. By complementation screening of a mutant library of SYO created by error-prone PCR, clones with an altered substrate specificity should result in the formation of canthaxanthin as main product. These clones would differ from the echinenone-producing orange clones by a pink-red pigmentation. Screening of 35000 clones yielded no clone with an altered coloration. However, further investigations revealed that by variation of the cultivation conditions canthaxanthin can be obtained as main product, even by the wild type SYO enzyme.