Etablierung von neuen Methoden zur Herstellung rekombinanter Antikörper und zur spezifischen Selektion von Antikörpervarianten im hohen Durchsatz

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst rekombinante herbizidspezifische Antikörperfragmente (single chain Fragmente und Fab Fragmente) in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Dies gelang jeweils durch genomische Integration der codierenden Gene. Im Fall des atrazinspezifischen Fabs K411B wurden hierfür mehrere Vektoren hergestellt, die jeweils die Gene beider Ketten als Fusion mit der a-Faktor-Signalsequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors enthielten. Somit konnten nach Transformation eines einzigen Vektors in Pichia beide Antikörperketten exprimiert und ins Medium sekretiert werden. Es zeigte sich, daß Klone mit beiden Genen unter Kontrolle des methanolinduzierbaren AOX1 Promotors größere Mengen Fab exprimierten, als solche mit den Antikörpergenen unter Kontrolle des konstitutiven GAPDH-Promotors. Durch fed-batch Kultivierung im 5l Bioreaktor konnten schließlich 40 mg l-1 Fab exprimiert werden. Wie sich durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte, bildeten ca. 30 % der schweren und leichten Ketten komplette Fab Fragmente. Auch im Falle des scFv K411B konnte mit Klonen, die das scFv-Gen als Fusion mit dem a-Faktor unter Kontrolle des AOX1-Promotors genomisch integriert trugen deutlich mehr exprimiert werden. Die Bindungseigenschaften des scFv und des Fab K411B wurden mit einem direkten, kompetitiven ELISA bestimmt: Wie erwartet zeigten beide Antikörperfragmente Testmittelpunkte von ca. 3 µg l-1. Dieser lag damit jedoch um ca. eine Größenordnung höher, als der mit dem parentalen monoklonalen Antikörper K4E7 gemessene Wert von ca. 0,2 µg l-1. Die Kreuzreaktivitäten der verschiedenen rekombinanten Antikörper stimmten jedoch nahezu mit denen des mAk überein. Die Entfernung mehrerer Restriktionsschnittstellen in dem für die Expression des Fab K411B hergestellten Expressionsvektor ermöglichte dessen Verwendung zur Herstellung von Fab Fragmenten beliebiger Spezifität durch einfachen Austausch der nun durch singuläre Schnittstellen begrenzten variablen Domänen. Dies wurde durch Expression eines 2,4-D-spezifischen Fabs validiert. Obwohl die exprimierte Menge deutlich geringer, als die des Fab K411B war, konnte mittels ELISA eine sigmoidale Bindungskurve zur Bestimmung von 2,4-D erstellt werden, aus der sich ein Testmittelpunkt von ca. 10 µg l-1 ergab. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neben dem ELISA weitere Methoden zur Messung der Bindungseigenschaften von Antikörpern etabliert und bezüglich ihrer Eignung zum Screening von Antikörperbibliotheken in hohem Durchsatz getestet: Zunächst wurde ein auf Fluoreszenzpolarisation beruhender homogener, kompetitiver Assay entwickelt. Mit einem Testmittelpunkt von ca. 90 µg l-1 bei der Bestimmung von Atrazin wäre für Anwendungen in der Umweltanalytik jedoch eine Optimierung hinsichtlich einer verbesserten Sensitivität notwendig. Aufgrund seiner im Vergleich zum ELISA sehr schnellen Durchführbarkeit, wäre der Einsatz als Schnelltest im mittleren Durchsatz geeignet und weniger für ein Screening im hohen Durchsatz, da die Ergebnisse im Vergleich zum ELISA weniger genau und reproduzierbar waren. Zum Screening von Antikörperbibliotheken und zur Selektion von Varianten mit bestimmten Bindungseigenschaften im hohen Durchsatz, wie es für evolutive Methoden erforderlich ist, wurde ein Hefeoberflächenexpressionssystem etabliert. Diese mit dem Phagen-Display verwandte Methode ist im Gegensatz zum ELISA und zum Fluoreszenzpolarisationstest vom Mikrotiterplattenformat unabhängig, da die Bestimmung der Bindungseigenschaften sowie die Selektion von Varianten mit dem Durchflußcytometer erfolgt: Durch Fusion der Gene der scFv's mit dem Gen einer Domäne des Agglutininrezeptors gelang nach Transformation des Fusionsgenes die Expression und Präsentation des daraus resultierenden funktionellen Fusionsproteins auf der Hefeoberfläche. Die damit erreichte Kopplung von Geno- und Phänotyp erlaubt durch Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antigenen und/oder Epitop-spezifischen Antikörpern und nachfolgender Analyse und Sortierung am Durchflußcytometer das Screening und die Selektion von Hefezellen, die Antikörper mit speziellen Bindungseigenschaften exprimieren. Die erfolgreiche funktionelle Expression der verschiedenen scFv's auf der Hefeoberfläche wurde durch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Laserscanning-Mikroskopie sowie FACS-Messungen überprüft und bestätigt. Eine Vereinfachung der Screeningmethode wurde durch Expression des scFv-EGFP auf der Oberfläche der Zellen erreicht: Damit kann auf die für die Bestimmung der Oberflächenexpressionsmenge notwendige Markierung der scFv's mit Epitop-spezifischen fluorezenzmarkierten Antikörpern verzichtet werden, da die Fluoreszenz des EGFP-Anteils direkt mit der Menge des exprimierten Fusionsproteins korreliert.

The first part of this study comprised the expression of recombinant, herbicide-specific antibody fragments (single chain and Fab fragments) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. For the Fab and the scFv this has been achieved by the integration of the encoding genes into the genome of Pichia. In case of the atrazine-specific Fab K411B two vectors each containing both genes encoding the heavy and light chain each fused to the a-factor signal sequence under control of separate promoters were constructed. By this way it was possible to express both genes upon transformation of a single vector into Pichia. Clones harboring the genes under control of the methanol-inducible AOX1 promoter showed a significant higher expression level than clones expressing the genes constitutively under control of the GAPDH promoter. By fed-batch cultivation of a selected clone in a 5l benchtop bioreactor 40 mg l-1 Fab were expressed. As shown by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions approximately 30 % of the secreted heavy and light chains assembled and built the complete Fab. Also in case of the scFv K411B strains harboring the scFv encoding gene under control of the AOX1 promoter showed a higher expression level. The binding properties of both antibody fragments were analyzed by a direct, competitive ELISA: The IC50 values for the determination of atrazine measured with both fragments were nearly identical (3 µg l-1), but one order of magnitude higher than that of the parental monoclonal antibody (mAb) K4E7 (0,2 µg l-1). The crossreactivity pattern towards several s-triazines of the recombinant fragments was nearly the same as the one determined with the parental mAb. The removal of several restriction sites from the vector for the expression of the Fab K411B raised the possibility to use this modified vector for the production of Fab fragments with any desired specificities by exchange of the variable domains using single restriction sites. This was validated by exchange of the VH- and VL-genes encoding the variable domains of the Fab K411B by the respective genes of a 2,4-Diphenoxyacetic acid (2,4-D) specific Fab fragment and the subsequent expression of the new 2,4-D-specific Fab. Although the expression level of this Fab was lower than that of K411B, sigmoidal binding curves leading to an IC50 value for the detection of 2,4-D of ~ 10 µg l-1 were obtained. The second part of this study comprised the establishment of additional assays for the measurement of antibody binding properties and the evaluation concerning the applicability for screening of antibody libraries in a high throughput. First, a homogenous, competitive assay based on fluorescence polarization was developed. With the obtained IC50 of ~ 90 µg l-1 for the detection of atrazine an improvement of this assay concerning sensitivity is needed for applications like environmental analysis. Although it can be performed within several minutes, it is more suitable to be used as a fast assay in a middle throughput than in a high throughput system due to its microtiter plate based format and the imprecise and sometimes hardly reproducible results obtained. For the screening of antibody libraries and the selection of variants with desired properties in a high throughput as it is needed for the directed evolution of antibodies, a method similar to phage display was established: By fusion of the genes encoding the herbicide specific scFv's with the gene of one domain of the membrane bound agglutinin receptor the functional expression and presentation of the respective fusion protein on the yeast cell wall was achieved upon transformation of the fusion gene into Saccharomyces cerevisiae. The coupling of the geno- and phenotype in this system allows the screening and selection of the yeast cells by FACS analysis upon labeling the cells with fluorescence-coupled epitope-specific antibodies and/or fluorescence-labeled antigens. The functional expression and secretion of the two scFv's onto the surface of the cells was confirmed by fluorescence microscopy, laser-scanning microscopy and flow cytometry. A simplification of the screening system was achieved by surface expression of the scFv-EGFP fusion protein: No labeling of the cells with epitope specific antibodies was necessary by this way, as the fluorescence of the EGFP domain of the fusion protein directly correlates with the expression level of the fusion protein. The knowledge of the expression level is important for the screening of libraries as the yield of the labeling with antigen is influenced by the amount of the expressed antibody in addition to its affinity.