Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris

Abstract

Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod.

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt.

Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.

The enzyme lactase-phlorizin-hydrolase (LPH; EC 3.2.1.23/62) catalyzes the hydrolysis of lactose (milk sugar), a disaccharide which can be found in dairy products, during digestion. It is located on the brush border membrane of mammalian small intestine absorptive epithelial cells. The enzymatic activity of lactase-phlorizin-hydrolase is elevated during the suckling period but decreases with weaning. This results in lactose intolerance in 75 % of the world's population, whereas populations with a history of consuming dairy products such as Northern Europeans and some african populations tolerate lactose well. There are two diseases connected with the metabolism of lactose: lactose intolerance and galactosemia. Lactose intolerance is either caused by a loss of activity or a defect in the synthesis of lactase, whereas galactosemia, which is a more severe disease, is based upon a genetic defect in galactose-1-phosphate-uridyltransferase (GALT), causing demetia or death.

The primary goal of this thesis was to produce active lactase-phlorizin-hydrolase. A further goal is to investigate a possible novel strategy to treat galactosemia. The fundamental idea behind this work was to prevent the destructive illness associated with galactosemia by inhibiting lactase-phlorizin-hydrolase the first enzyme of lactose metabolism, while the less severe symptoms of lactose intolerance remain. Human lactase-phlorizin-hydrolase (LPH) was expressed in the yeast Pichia pastoris. A disaccharidase assay by Dahlqvist was adapted to microtiter plate format and used to quantify lactase activity. The assay can also be utilized to screen for substances which inhibit the lactase-phlorizin-hydrolase, respectively the single domains of the enzyme.

Lactose-phlorizin-hydrolase was isolated from a biopsy of human small intestine. Total-RNA from the small intestine tissue was first extracted and translated into cDNA by way of reverse transcriptase. The lactase- and phlorizin-hydrolase-domains of lactose-phlorizin-hydrolase were amplified by PCR. The alignment of their DNA-sequences with the data published by Mantei et al. in 1988 showed 6 differing nucleotides for each domain. These variations are assumed to be single nucleotide polymorphisms (SNPs). Splicing by overlap extension-PCR of both single domains yielded total mature lactose-phlorizin-hydrolase with added divergencies in its nucleotide sequence. These new variations are thought to be mutations, because they don't occur in the individual domains before splicing by overlap extension. Both the lactase- and the phlorizin-hydrolase-domain, as well as the total LPH were expressed in the eukaryotic yeast Pichia pastoris. The resulting products were tested for lactose-hydrolytic activity using the adapted Dahlqvist disaccharidase assay. Lactase activity was demonstrated for the recombinant lactase-domain and total lactose-phlorizin-hydrolase, whereas the isolated phlorizin-hydrolase domain showed only low lactase activity. Therefore, lactase activity can be said to be a property of the lactase-domain of lactose-phlorizin-hydrolase. In spite of their variations in comparison with the published sequences the recombinant proteins were enzymatically active. This proves the expression by Pichia pastoris to be a simple system to test the activity of variants of the LPH. Before carrying out further experiments with this system, a gene without mutations should be generated to make possible comparisons with the data from the literature and to determine the number of polymorphisms in this gene. In the second phase of this work, the modified Dahlqvist assay was tested for its ability to detect lactase inhibitory activity, for example using a library of synthetically produced compounds. The reliability of this assay was confirmed using phlorizin, a known inhibitor of lactase-phlorizin-hydrolase. In addition the suitability of the recombinant proteins for inhibition tests in spite of their variations is proven. Thus the developed system allows direct screening for inhibitory effects of synthetically produced compounds against lactase-activity and furthermore the examination of how inhibitors affect different variations of a protein.

The first tests with a synthetically produced inhibitor for ß-glucosidases and ß-galactosidases, JG 227, which was produced at the institute of organic chemistry of the university of Stuttgart, showed inhibitory effects on the lactase activity of the expressed, recombinant proteins. Further screening of substances using this assay could result in the characterization of new inhibitors and in the development of alternative methods in the treatment of galactosemia.