Cloning, expression, purification and characterization of a novel cytochrome P450 isolated from Thermus thermophilus HB27

Abstract

Enzymes produced by extremophiles are of considerable biotechnological interest. They show activity and stability at extreme temperatures, low water activity and high hydrostatic pressure. The growing knowledge about "thermozymes" from thermophilic organisms obtained during the recent years and the importance of P450 monooxygenases as potential biocatalysts for industrial applications has created high interest in P450 enzymes from thermophilic bacteria and archaea. Although the homology between P450s is generally low, a few domains and sequence signatures are conserved and can be identified by homology searches. Following this approach a homology search of recently sequenced genomes from thermophiles was performed to identify novel P450 enzymes of this origin. Indeed, a region showing homology to a known bacterial P450 (P450 BM3 from Bacillus megaterium) was found within the Thermus thermophilus HB27 genome, currently being sequenced in Göttingen. Thermus thermophilus is a non-sporulating Gram-negative bacterium isolated from hot springs. Its genome of 1.82 Mbp (excluding the mega-plasmid pTT27 of 0.24 Mbp) has a GC-content of approximately 69 %. The optimal temperature for growth is between 65 and 72 °C, the maximum being 85 °C and the minimum being 47 °C. Bulk protein extracted from this thermophile is much more stable to heat than mesophilic protein extracts; and only about 10 % of the total protein is denatured by heating up to 110 °C for 5 min. Cytochrome P450 proteins, named for the absorption band at 450 nm of their carbon monoxide bound form, are a large superfamily of enzymes. P450s are ubiquitous enzymes essential for steroid biosynthesis, catabolism of drugs, utilization of carbon compounds as an energy source in bacteria, and in the production of various macrolide antibiotics. Sequence identity among P450s is often low (normally less than 20 %), but the structural fold has been conserved during evolution. P450s are heme thiolate proteins; the most conserved structural feature is a cysteine as fifth ligand to the heme iron. Normally P450s use electrons from NAD(P)H to catalyze activation of molecular oxygen, leading to regiospecific and stereospecific oxidative attack (often hydroxylation) of non-activated hydrocarbons at physiological temperatures. The substrates of P450s are extremely diverse. They are involved in the biosynthesis of hormones or antibiotics, as well as carcinogenesis and degradation of xenobiotics. The selective oxidation of an unactivated C-H bond in a complex organic molecule to the alcohol functionality (C-OH) has wide applications in chemical synthesis. The present work reports cloning, expression, purification, crystallization and characterization of CYP175A1, a cytochrome P450 from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB27. For over expression the gene was amplified by PCR in the presence of specific primers from a DNA fragment kindly provided by Prof. H. J. Fritz (University of Göttingen). The PCR product was ligated into the polylinker region of pKK223-3 for expression under control of the tac promoter. The resulting clone was transformed in E. coli BL21(DE3)RP CodonPlus and selected for ampicillin and chloroamphenicol resistance. Expression was induced by IPTG and a yield of approx. 40 mg protein/liter culture was obtained. After cell disruption and ammonium sulfate precipitation P450_Tth was purified to homogeneity, following two different purification protocols. The fractions corresponding to the highest purity were used for crystallization, while the others were used for further biochemical characterization. The 44 kDa protein is soluble and displays an absorption spectrum in the reduced, oxidized, and carbonyl adduct analogous to those of other P450 enzymes. This enzyme exhibits thermostability with a melting temperature 30 °C higher than that of P450cam from P. putida. The crystal structure of CYP175A1 has been determined in co-operation with T. Poulos (University of California, Irvine). CYP175A1 exhibits the typical prism like P450-fold composed of 17 a-helices and 11 b-strands, corresponding to four beta sheets. The location of CYP175A1 in the T. thermophilus genome (close to crtB encoding a phytoene synthase), and the fact that genes for carotenoid biosynthesis occur as a cluster in T. thermophilus as well as in other carotenoid-producing strains, suggested that the gene may be involved in carotenoid biosynthesis. Heterologous complementation using Escherichia coli strains genetically enginereed to produce b-carotene indicated that CYP175A1 was able to catalyze the conversion of b-carotene to zeaxanthin via cryptoxanthin. The model of the b-carotene-CYP175A1 complex was generated. The hydrophobic nature of the ligand fitted well into the binding site of CYP175A1 which contained mostly hydrophobic or neutral residues. The position of the ligand in the active site of the enzyme showed that the C-3 of the b-ionone ring is the closest atom to the heme iron confirming the experimentally observed regioselectivity.

Cytochrome sind Proteine, die in tierischen und menschlichen Organismen in der "Atmungskette", einem Teilprozeß der oxidativen Phosphorylierung, vorkommen. Das Suffix "450" erhalten bestimmte Cytochromsysteme, weil sie mit dem starken Inhibitor CO (Kohlenmonoxid) einen Komplex bilden, der Licht mit einer Wellenlänge von 450 nm absorbiert. Cytochrome P450 führen aliphatische und aromatische Hydroxylierungen, Oxidationen, Epoxidierungen, Reduktionen sowie Dehalogenierungen aus. Durch die Hydroxylierung von -X-CH3 (X = O, S, NR) sind die entsprechenden Dealkylierungen möglich. Die CYP-Enzyme sind bezüglich der Substratspezifität sehr variabel. Sie sorgen für die Metabolisierung endogener Substanzen wie auch für die Umwandlung xenobiotischer Substanzen. Die Suche nach P450-Genen im Genom von thermophilen Mikroorganismen führte zur Identifikation einer Region im Genom von Thermus thermophilus mit einer Homologie zu P450 BM3 (Monooxygenase-Domäne) aus Bacillus megaterium. Obwohl die allgemeine Homologie, wie üblich bei P450-Proteinen, nicht besonders hoch war, zeigten die Aminosäuresequenzen in einigen Bereichen hohe Übereinstimmung. Das P450_Tth wies die typischen Sequenzmerkmale auf. Thermus thermophilus HB27 ist ein aus heißen Wasserquellen isoliertes Gram-negatives Bakterium. Sein Genom wird zur Zeit am Institut für Mikrobiologie und Genetik der Universität Göttingen sequenziert. Der GC-Gehalt des Genoms beträgt ca. 69 %. Die optimale Kultivierungstemperatur für Thermus liegt zwischen 47 und 85 °C. Proteine aus Thermus thermophilus sind im allgemeinen thermostabil, nur 10 % der gesamten Proteine werden nach 5 minutiger Inkubation bei 110 °C denaturiert. Diese Arbeit behandelt die Klonierung, Expression Aufreinigung und Charakterisierung eines neuen P450-Enzyms aus T. thermophilus HB27. Das kodierende Gen der P450-Monooxygenase wurde mittels PCR amplifiziert und in einen passenden Expressionsvektor kloniert. Für die rekombinante Expression wurde E. coli BL21 CodonPlus verwendet, denn die Seltenheit einiger Kodons schien der limitierende Faktor für die Expression in anderen E. coli Stämmen zu sein. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen konnten 40 mg P450 in einem Liter Kulturmedium nachgewiesen werden. Abhängig von der für verschiedene Anwendungen benötigten Reinheit des P450 Proteins wurden zwei unterschiedliche Aufreinigungsprotokolle etabliert. Das Enzym aus Thermus zeigte die typischen spektroskopischen Eigenschaften der P450-Monooxygenasen. Im UV-VIS Bereich besaß das Protein im oxidierten Zustand ein Absorptionsmaximum bei 417 nm (so genanntes Soret Band). Der reduzierte CO-Komplex des Cytochroms-P450 zeigte das typische Absorptionsmaximum bei 450 nm. Die g Werte des EPR Spektrums waren denen anderer P450-Monooxygenasen sehr ähnlich. Dies deutete an, dass die Orientierung und die Natur der Liganden des Häm-Eisens denen in anderen P450-Systemen weitgehend entspricht.Untersuchungen bezüglich der Thermostabilität zeigten, dass der Schmelzpunkt des P450-Enzyms aus T. thermophilus bei 88 °C lag. Die Kristallstruktur des P450 aus T. thermophilus wurde von T. Poulos innerhalb eines gemeinsamen Projekts aufgeklärt. Die Struktur zeigt die typische P450-Faltung mit 17 a-Helices und 11 b-Strängen, die 4 b-Faltblättern entsprechen. Nach der Etablierung von Expression und Aufreinigung für das P450 aus Thermus thermophilus wurden Experimente zur Evaluierung des Substratspektrums durchgeführt. Die Substratsuche bei P450-Systemen im allgemeinen, besonders jedoch bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Enzym, ist häufig schwierig. Da die P450-Enzyme von weiteren, Elektronen-liefernden Enzymen abhängig sind, müssen artifizielle Systeme verwendet werden, die diese Aufgabe übernehmen können, falls der natürliche Redoxpartner unbekannt ist. Desweiteren war das potentielle Substratspektrum des untersuchten Enzyms extrem groß, da die P450-Monooxygenasen eine enorme Substratvariabilität und eine Vielzahl verschiedener Reaktionstypen aufweisen. Die sorgfältige Analyse der Region des Thermus Genoms, in der sich das P450 Gen befindet, führte zur Entdeckung des kodierenden Gens für die Phytoin-Synthase (crtB). Die Herstellung von Carotinoiden sowie die Anordnung carotinogener Gene in einem Cluster wurde in Thermus thermophilus schon nachgewiesen. Aus diesen Informationen ließ sich vermuten, dass P450 aus T. thermophilus ein carotinogenes Enzym sein könnte. Mittels in vivo heterologe Komplementation mit modifizierten E. coli Zellen, die Carotinoide bildeten, konnte die katalytische Aktivität des Thermus P450 als b-Carotin-Hydroxylase nachgewiesen werden. Das P450 aus T. thermophilus katalysierte die regioselektive Umsetzung von b-Carotin zu Zeaxanthin via Cryptoxanthin. In silico Experimente bestätigten, dass b-Carotin sehr gut in die Bindungstasche des Enzyms passt. Ein Modell des Enzym-Substrat-Komplexes wurde hergestellt, das die experimentelle Regioselektivität erklären konnte.