Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution

Abstract

<alpha->Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden <alpha->Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die <alpha->Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen <alpha->Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.

<alpha->Amylases are widely used in detergency. This application requires <alpha->amylases with activity and stability at alkaline pH. In addition, a high specific activity is desired reducing enzyme amount and therefore costs. The aim of this work was to establish and successfully use methods of directed evolution on the <alpha->amylase from Bacillus amyloliquefaciens (BAA) in order to improve the specific activity and the activity at alkaline pH as an example for altering two relevant parameters for the application in detergency. The genes coding for the wild type BAA and for two point mutants were subjected to error-prone PCR and gene shuffling. For the screening of mutants a novel, reliable assay suitable for high throughput screening was developed based on the commercially available Phadebas(r) assay. Mutant 42 has an optimal activity at pH 7, corresponding to a shift of one pH unit compared to the wild type. It is active over a broader pH-range than the wild type resulting in a fivefold higher activity at pH 10. In addition, the activity in periplasmic extracts and the specific activity increased 4-and 1.5-fold, respectively. Another mutant, mutant 29 possesses a wild type like pH-profile but reveals a 40-fold higher activity in periplasmic extracts and a nine fold higher specific activity. Mutant B1 which was yielded from a second round of error-prone PCR with mutant 29 as template shows the same pH activity profile as mutant 29 and the wild type but possesses a the specific activity lower than that of mutant 29, but still 4.2 times higher than of the wild type. The comparison of the amino acid sequences of these mutants with the wild type and homologous microbial <alpha->amylases revealed the influence of some mutations on the activity profile and on the specific activity.