Unterschiedliche Funktionen der Ionenpumpe Pmr1

Abstract

Freies cytosolisches Ca2+ erfüllt in Eukaryonten für viele zelluläre Prozesse die Funktion eines "second messengers" und unterliegt daher einer exakten Kontrolle, um die normale Physiologie der Zelle aufrecht zu erhalten. Auf einen raschen Anstieg der cytosolischen Ca2+- Konzentration erfolgt ein aktives Entfernen des Ca2+ aus dem Cytosol. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae geschieht dies durch die Ca2+- ATPasen Pmc1 und Pmr1, sowie durch den Ca2+/H+ Antiporter Vcx1. Der Weg auf dem überschüssiges Ca2+ wieder aus der Zelle ausgeschieden werden kann, ist bisher unbekannt. Eine Plasmamembran Ca2+- ATPase, wie von Säugerzellen bekannt, scheint in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nicht zu existieren. Da Ca2+ in allen Subkompartimenten des Sekretionswegs eine wichtige Rolle spielt und zu dem dort im Vergleich zum Cytosol in wesentlich erhöhten Konzentrationen nachgewiesen wurde, liegt es nahe zu vermuten, dass Ca2+- verpackt in sekretorische Vesikel - die Zelle durch Exocytose verlassen könnte. Diese Hypothese wurde an Hand von Ca2+- Ausstrommessungen an verschiedenen Hefestämmen untersucht. Anhand von Stämmen, die aufgrund einer sec- Mutation ein temperatursensitives Sekretionsverhalten aufweisen, konnte gezeigt werden, dass Ca2+ , verpackt in sekretorische Vesikel, entlang des Sekretionswegs zur Plasmamembran transportiert und bei der Fusion der post- Golgi Vesikel mit der Plasmamembran aus der Hefezelle freigesetzt wird. Der Ca2+- Ausstrom erfolgt also über Exocytose. In einem weiteren Projekt wurde der Aminosäuretransport durch die Aminosäurepermease Gap1 in delta- pmr1- Zellen untersucht. Kinetische Transportmessungen mit radioaktiv markierten Aminosäuren ergaben, dass die Transportaktivität von Gap1 in delta- pmr1- Zellen drastisch reduziert ist und dass vermutlich eine Form von unkompetitiver Inhibierung von Gap1 in delta- pmr1-Zellen vorliegt. In einem dritten Projekt wurde nach genetischen Interaktionspartnern von Pmr1 gesucht. Dabei wurde festgestellt, dass delta- pmr1 delta- bst1, delta- pmr1 delta- sac2, delta- pmr1 delta- vps24 Doppelmutanten auf YPD- Platten einen starken Wachstumsdefekt aufweisen.

The cytosolic free Ca2+- concentration of the yeast Saccharomyces cerevisiae is maintained at extremely low levels by the activity of the P- Type Ca2+- ATPases Pmc1 and Pmr1, and the antiport Vcx1. This is necessary because a transient increase in the cytosolic Ca2+ concentration regulates a wide variety of cellular processes. Animal cells exert tight control of free Ca2+ in the cytosol by balancing Ca2+ sequestration into internal stores with Ca2+ extrusion through well- studied Ca2+ pumps located at the plasma membrane. However a plasma membrane Ca2+ pump seems not to be existing in Saccharomyces cerevisiae. Very high Ca2+ concentrations are found in the organelles of the secretory pathway: therefore, it seems possible that Ca2+ is transported along the secretory pathway wrapped into secretory vesicles, which fuse with the plasma membrane to free their content by exocytosis. Here, we studied Ca2+ efflux out of different sec mutant strains at permessive and restrictive temperature. The result of the experiments show that the Ca2+ is extruded out of the cell by exocytosis. In a second project the amino acid transport by the general amino acid permease Gap1 was measured in delta- pmr1- cells. The transport activity of Gap1 in delta- pmr1 cells is drastically reduced, maybe by some sort of uncompetitive inhibition.