Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba

Abstract

The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.

Die besondere mikrobiologische Ökologie im Mesophyl von Schwämmen birgt in Bezug auf die große Anzahl taxonomisch unterschiedlicher Bakterien ein beträchtliches Potential für die Biotechnologie. Diese bislang uncharakterisierten Mikroorganismen stellen eine potentielle Quellen für neuartige Enzyme und bioaktive Substanzen dar, welche sich in der Regel deutlich in ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften von denen aus terrestrisch Mikroorganismen isolierten Verbindungen unterscheiden. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung und physiologischen Charakterisierung eines neuen Bacillus-Stammes mit dem Namen Bacillus sp. 01-855, der aus dem marinen Schwamm Aplysina aerophoba isoliert wurde. Zwei neuartige Esterasen (EC 3.1.1.1) mit den Namen EstB1 und EstB2 und eine putative Amidase (EC 3.5.1.), die als AmdB1 bezeichnet wurde, wurden durch Plate-Assay-Test aus den chromosomalen DNA-Bibliotheken des Bacillus sp. 01-855 isoliert. Die Gene estB1, estB2 und amdB1 wurden in den pET-22b(+) Vektor kloniert und anschließend in E. coli expremiert. Die Enzyme EstB1 und EstB2 wurden in einem einzigen Arbeitsgang durch IMAC mit TALONTM (Clontech) aus E. coli aufgereinigt werden. Für die Umwandlung der inaktiven „Inclusion Bodies“ in ein lösliches aktives Protein wurde ein „Refolding“ für EstB2 entwickelt und angewandt. Die biochemische Charakterisierung der Esterasen EstB1 und EstB2 zeigte, daß beide einzigartige biochemische Eigenschaften besitzen, die bei verschiedene biotechnologische Anwendungen genutzt werden könnten. Bei der Amidase AmdB1 sind weitere Untersuchungen zu ihren biochemischen Eigenschaften notwendig.