A genomic screen in Saccharomyces cerevisiae identifies multiple new gene products essential for protein quality control of the endoplasmic reticulum and degradation: The role of Dsk2p, Rad23p and Yos9p

Abstract

Summary

The endoplasmic reticulum (ER) is characterized by the presence of a highly efficient quality control system, which recognizes malfolded proteins, and inhibits their further transport to the secretory pathway. These proteins are retrotranslocated back into cytosol where they are polyubiquitinated and degraded by the 26S proteasome. This process is known as ER- associated degradation or ERAD. Failure of this process results in inactive proteins forming insoluble aggregates, which ultimately lead to cellular malfunction and unhealthy states. To gain a deeper insight into the molecular mechanisms of protein quality control and ER-associated degradation, a genome wide screen using the EUROSCARF yeast library, consisting of about 5, 000 Saccharomyces cerevisiae strains each deleted for a single non-essential gene was undertaken. Such a screen is possible as cells tolerate a defect in this process as long as the unfolded protein response is intact. As cell growth is one of the most sensitive indicators of alterations in cell physiology due to mutations, a growth phenotype test to identify new mutants in quality control and ERAD was devised. Previously the membrane-localized ERAD substrate CTG* has been described, which consists of an ER-lumenal malfolded CPY* domain connected to the green fluorescent protein (GFP) in the cytoplasm via a transmembrane domain. To screen for new mutants the cytoplasmic GFP moiety was replaced with the Leu2 protein (3-isopropylmalate-dehydrogenase). This new construct called CTL* was placed under the control of the weak GAL4 promoter. Consequently strains with leu2 auxotrophy, but otherwise, wild type for ERAD are unable to grow in the media lacking leucine. Only when ERAD is defective, CTL* is stabilized and able to complement the leu2 deficiency. The low expression of CTL* then allows for sharp growth differences to be easily observed. Advantage of this growth phenotype was taken of to screen the 5, 000 individual deletion mutants of the EUROSCARF yeast library expressing CTL*. Strains defective in most of the known ERAD components resulted in growth in the absence of leucine, highlighting the reliability of the selection procedure. Apart from the genes known to be defective in ER quality control, we identified a reproducible growth phenotype of approximately 25 mutants. The role of the proteins defined by the mutated genes in ERAD was not described earlier. Out of the new genes identified in the screen, the function of two proteasome interacting proteins Dsk2p and Rad23p were characterized as adapters for transferring the ERAD substrates from the trimeric Cdc48 complex to the 26S proteasome. Degradation of two well characterized ERAD substrates, soluble CPY*HA and membrane-anchored CTG* is significantly delayed in a ?dsk2?rad23 double mutant, indicating that these proteins directly participate in ERAD. Microsomal extracts from a ?dsk2?rad23 strain showed the accumulation of large amounts of polyubiquitinated CPY*HA in the cytosol as a consequence of failed delivery to the proteasome, and are in agreement with a role for Dsk2p and Rad23p downstream of the Cdc48-Ufd1-Npl4p complex. It is believed that, Dsk2p and Rad23p transfers, malfolded substrates of the ER from the AAA-ATPase Cdc48 complex to the proteasome by this maintaining an uninterrupted path from the ER membrane to the proteasome, thus preventing the formation of insoluble protein aggregates in the cytoplasm. The studies further more show that the function of Dsk2p and Rad23p in transferring multiubiquitinated substrates to the 26S proteasome is pathway specific and depends on the presence of the trimeric AAA-ATPase Cdc48 complex. In addition the function of an ER lumenal glycoprotein, Yos9p was identified as a lectin or lectin like protein specifically involved in the degradation of misfolded glycoproteins, but not for the degradation of misfolded non glycosylated ERAD substrates. Yos9p posses a mannose-6-phosphate receptor homology (MRH) domain and degradation of model glycoprotein ERAD substrates CPY*HA and CTG* is significantly delayed in a ?yos9 strain. The ?yos9 strain has no influence in the turnover of non-glycoprotein ERAD substrate, Sec61-2p, suggesting a lectin like activity for Yos9p in the quality control of glycoproteins in the secretory pathway. The genetic screen also resulted in the identification of many additional proteins whose function with regard to ER quality control and degradation can be explored in future.

Zusammenfassung

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist das Kompartiment in eukaryontischen Zellen, in dem Proteine des sekretorischen Systems ihre native Konformation erhalten. Für diesen Prozess enthält das ER ein effizientes System aus faltungsunterstützenden und kontrollierenden Proteinen. Sekretorische Proteine, die ihre endgültige native Konformation nicht erlangen können, werden durch ein Qualitätskontrollsystem im ER erkannt, in das Cytosol zurücktransportiert und dort über das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Dieser Prozess wird auch als ER-assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet. Viele molekulare Mechanismen und die daran beteiligten Komponenten der Proteinqualitätskontrolle und des ERAD sind noch unbekannt. Daher war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, neue Komponenten dieser Prozesse zu identifizieren und ihre mögliche Funktion in der Qualitätskontrolle und im ERAD zu analysieren. Zu diesem Zweck wurde eine EUROSCARF Stammsammlung (Universität Frankfurt) durchsucht (genomischer Screen), die 5000 verschiedene Mutantenstämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae enthält. Zur Identifizierung der Mutanten in dieser Sammlung, die einen Defekt in der Proteinqualitätskontrolle oder im ERAD aufweisen, wurde ein sensitiver Wachstumstest etabliert. Es wurde ein Plasmid erstellt, das zur Expression eines ERAD Substrates führt und aus einem ER lumenalen, fehlgefalteten Glycoprotein CPY* in Fusion mit einer Transmembrandomäne und einem cytosolisch orientierten Leu2 Protein (Isopropyl-Malatdehydrogenase) besteht. Das resultierende Fusionsprotein CTL* wurde unter Kontrolle des GAL4-Promotors gestellt, der zu einer geringen Expression führt und den Screen erst ermöglichte. Das für CTL* kodierende Plasmid wurde in alle 5000 verschiedenen leu2-auxotrophen Mutantenstämme transformiert und der Wachstumsphänotyp auf Leucin defizienten Medien untersucht. Nur wenn CTL* stabil war und nicht abgebaut wurde, war der transformierte Mutantenstamm in der Lage, auf Leucin defizienten Medien zu wachsen. Mit diesem Wachstumstest konnten zum einen Mutanten identifiziert werden, deren deletierte Gene für bereits bekannte ERAD Komponenten kodieren. Dies unterstreicht die Sensitivität und Spezifität dieses Wachstumstests. Zum anderen konnten zusätzlich 25 Mutanten identifiziert werden, die ein reproduzierbares Wachstum auf Leucin defizienten Medien aufwiesen. Für die zugehörigen 25 Gene und deren Genprodukte war bisher noch keine Funktion im ERAD bekannt. Unter diesen neu gefundenen möglichen ERAD Komponenten wurden die mit dem Proteasom interagierenden Proteine Dsk2p und Rad23p hinsichtlich ihrer Funktion im ERAD untersucht. Durch metabolische Markierung mittels radioaktivem Methionin in Pulse-Chase Analysen konnte eine Stabilisierung der ERAD Substrate CPY*HA und CTG* in der Doppeldeletionsmutante ?dsk2?rad23 gezeigt und damit eine Beteiligung von Dsk2p und Rad23p am ERAD belegt werden. Des weiteren weist die Akkumulation polyubiquitinylierter Proteine in der cytosolischen Fraktion des Stammes ?dsk2?rad23 nach subzellulärer Fraktionierung auf einen Defekt im Transport zum Proteasom hin. Diese Daten führten zu dem Modell, in dem Dsk2p und Rad23p als Adaptoren für den Transfer fehlgefalteter, polyubiquitinylierter Proteine vom trimeren Cdc48-Komplex zum Proteasom fungieren. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass der Transfer fehlgefalteter Protein im Cytosol ein gezielter, ununterbrochener Prozess ist, der die Bildung unlöslicher Proteinaggregate in der Zelle verhindert. Des Weiteren wurde die Funktion des ER lumenalen Proteins Yos9p charakterisiert, das ebenfalls in dem beschriebenen Screen identifiziert werden konnte. Die Untersuchungen zur Degradation der ERAD-Substrate CPY*HA und CTG* in der Deletionsmutante ?yos9 zeigten eine deutliche Stabilisierung dieser fehlgefalteten Glykoproteine, während die Deletion von YOS9 keinen Einfluss auf den Abbau des nicht glycosylierten Substrates Sec61-2p hat. Yos9p besitzt somit wahrscheinlich eine Lektin-ähnliche, zuckerbindende Funktion innerhalb der Qualitätskontrolle im ER speziell für sekretorische, fehlgefaltete Glycoproteine. In dem in dieser Arbeit durchgeführten genomischen Screen konnten neben den Proteinen Dsk2p, Rad23p und Yos9p, deren Funktion in der ER Qualitätskontrolle untersucht wurde, weitere 22 möglicherweise am ERAD Prozess beteiligten Komponenten identifiziert werden. Die Analysen zur Beteiligung dieser 22 Kandidaten an der ER-Qualitätskontrolle könnten das Verständnis der dem ERAD zugrundeliegenden molekularen Mechanismen deutlich erweitern