The novel proteasomal substrate Far10 contributes to control of mitotic exit in yeast

Abstract

Ubiquitin-Proteasome System (UPS) mediated proteolysis of an array of cellular proteins plays an important role in many basic physiological processes. Among these are control of cell cycle and division, differentiation and development, response to stress, transcriptional regulation, circadian rhythms, regulation of the immune and inflammatory responses, and biogenesis of organelles. Some of the well-known substrates of this system are cell cycle regulators such as cyclins, cyclin dependent kinase inhibitors, and proteins involved in sister chromatid separation, tumor suppressors, as well as transcriptional activators and their inhibitors [Glickman, 2002; Hilt, 2004; Wolf, D.H, 2004].

Due to these facts, identification and characterization of new substrates of the ubiquitin-proteasome system is important to reveal its cellular functions. For this purpose a high expression lethality [HEL] screen had been developed [Ledig, 1996; Velten, 1996, Velten, 2000]. This screen was based on the hypothesis that overexpression of a protein whose degradation by the ubiquitin-proteasome system is required for viability or growth, will cause a strong growth defect in cells where proteasome function is impaired, as for instance in pre1-1 pre4-1 mutants. An unknown protein originally designated as Hel48 now commonly termed as Far10 was identified, [Velten, 2000; Kemp and Sprague, Jr., 2003].

In this work cycloheximide chase experiments were undertaken to prove that Far10 is a novel substrate of the proteasome. Far10 expressed from its endogenous promoter on the chromosome either as N-terminally 19Myc tagged or as C-terminally 3Ha-tagged version was rapidly degraded in wild type cells and stabilized in pre1-1 pre4-1 proteosome mutants. Based on the ability of HA-tagged Far10 to cause lethality it was concluded that the tagged version of this protein is functional. Therefore the degradation rates seen with different tagged versions are supposed to be as wild type. The identical behavior of N-terminally and C-terminally tagged Far10 strongly support this idea.

Regulatory proteolysis is an important mechanism for major cell cycle transitions such as the initiation of DNA replication, separation of sister chromatids and exit from mitosis [Jan-Michael Peters, 1998; Hilt, 2004]. APC, an ubiquitin-protein ligase, consisting of 12 known subunits in Saccharomyces cerevisiae is essential for ubiquitin-dependent proteolysis during mitosis [Harper et al., 2002; Jan-Michael Peters, 2002]. It requires two substrate specific co-activators: Cdc20 and Cdh1/Hct1. Substrates of APCCdc20 complex include non-cyclins such as Pds1 [Cohen-Fix et al., 1996; Michaelis et al., 1997; Ciosk et al., 1998; Nasmyth, 1999] and cyclins such as Clb2 and Clb5 [Bäumer et al., 2000; Wäsch, 2002; Irniger, 2002; Cross, 2003]. APCCdh1 complex initiates degradation of the mitotic cyclin Clb2 in telophase and also mediates proteolysis of other proteins such as the spindle-associated protein Ase1, Cdc20 and the polo-like kinase Cdc5 [Schwab et al., 1997; Visintin et al., 1997; Shirayama et al, 1998]. Thus, Cdc20 and Cdh1 ensure that different target proteins of the APC are degraded in a proper temporal order during mitosis.

The participation of the anaphase-promoting complex and its co-activators in the degradation of Far10 was demonstrated by the observation of synthetic dosage effects in cdc23-1, cdc20-1 and hct1-?1 mutants. Cycloheximide decay analysis of 19Myc tagged Far10 in cdc23-1 APC mutants as well as cdc20-1 and proteasome mutants uncovered a clear proteolytic stabilization of N(myc)19Far10. On the contrary, a deletion of HCT1 had no effect on the degradation of Far10. These results confirm that Far10 is a genuine substrate of the APC and requires the specificity factor Cdc20 for its degradation. In addition to this, analysis of in-vivo ubiquitination experiments of Far10(HA)3 in wild type (WCG4) and pre1-1 pre4-1 proteasome mutants revealed that the polyubiquitinated forms of Far10(HA)3 accumulate in the pre1-1 pre4-1 proteasome mutants.

Substrates of APC and Cdc20 in particular identified till date have a nine amino acid conserved motif called the destruction [D] box which has a consensus sequence: RXXLXXVXN/D/E. Far10 being a substrate of APCCdc20 has a nine amino-acid sequence similar to the D box motif, 340RRKLSGKYE348 residing in the C-terminal region. To check the relevance of this motif in the degradation of Far10, site directed mutagenesis of 1) first two arginines (340, 341) to alanine and leucine and 2) leucine (343) to alanine was carried out. Overexpression of these two different mutant versions of Far10 in the wild type yeast strains did not result in toxicity. Moreover, cycloheximide chase analyses of N(Myc)19Far10(L343A) expressed from the endogenous promoter on the chromosome showed that this mutant protein was not stabilized in wild type yeast strains. These data suggest that this sequence in Far10 may not confirm to a classical D-box and that the degradation signals might be located else where in the protein. It could also be possible that mutations in this D-box have to be collective in order for the desired effect(s) to be seen.

Database analysis of FAR10 revealed an N-terminal FHA (fork head associated) domain and a C-terminal transmembrane domain. Cell fractionation experiments as well as immunofluorescence studies proved that Far10 localizes to the nuclear envelope [Velten, 2000]. To investigate the function of the C-terminal transmembrane domain, a deletion construct containing Far10 lacking the transmembrane domain, far10?TM was generated. In contrast to wild type Far10 this mutant protein was unable to cause synthetic dosage effects in pre1-1 pre4-1, cdc23-1 and cdc20-1 mutants. Immunofluorescence studies of Far10?TM(HA)2 revealed that this mutant protein was indeed mislocalized. These results provide evidence that the ability of Far10 to induce lethality depends on its correct localization to the nuclear membrane [Murray, 2001].

An investigation into the synthetic interactions of FAR10 with cdc20-1 mutant revealed that cdc20-1 far10? double mutants displayed a synthetic growth defect at 25°C. On the other hand far10? cdc23-1 double mutants showed no obvious growth effects when compared to cdc23-1 single mutants. The data imply that APC is fully active at 25°C in far10? cdc23-1 mutants. On the contrary cdc20-1 far10? double mutants at the same temperature may show a defective APC activity. These results propose that when APC-Cdc20 activity is disturbed, presence of Far10 is required.

The mitotic exit network [MEN] in budding yeast is a complex signaling cascade consisting of Tem1 (a GTPase); Cdc15, Dbf2 and Cdc5 (protein kinases); Cdc14 (a protein phosphatase); Mob1 (a Dbf2 associated factor); Bub2-Bfa1/Byr4 (a two component GTPase-activating Protein; GAP); Lte1 (a guanine nucleotide exchange factor; GEF) and a scaffold protein, Nud1 [Amon, 2001]. Tem1 is a positive regulator of MEN. The ultimate effector of MEN is Cdc14 and it is held inactive in the nucleolus by its inhibitor Cfi1/Net1 during G1, S, G2 and early M phase. MEN is activated when the spindle pole body reaches daughter cell where Lte1 (GEF) exchanges a GDP for GTP on Tem1. Thus activated, Tem1-GTP binds to and activates Cdc15, which in turn activates Mob1-Dbf2 complex. Dbf2 facilitates release of Cdc14 from the nucleolus. The freed Cdc14 functions to shut down mitotic Cdk activity by promoting expression of the Cdk inhibitor Sic1 and stimulation of degradation of the essential mitotic cyclins.

To outline the relation(s) of FAR10 with regulatory modules of the mitotic exit network a genetic method was executed. For this purpose, effects of FAR10 overexpression and inactivation were studied in MEN mutants. Overexpression of FAR10 in a string of MEN mutants was found to cause toxicity in cdc14-3, dbf2-2, and tem1-3 mutants, with cdc15-2 and cdc5-1 mutants displaying a mild effect and lte1? mutant showing no effect at all. These results prove that when MEN activation is defective cells become sensitive to Far10 overexpression. In contrast when MEN is hyperactive as in the case of bub2? mutants, the effect of overexpression of FAR10 is suppressed.

FAR10 is not an essential gene and its deletion causes no obvious growth defects when compared to wild type (W303) strain. Though far10? cdc14-3 double mutants showed no detectable growth effects at either 25°C or 30°C when compared to cdc14-3 single mutants, deletion of FAR10 in dbf2-2 mutants had a moderate suppression effect at 25°C. In the case of far10? tem1-3 double mutants this suppression effect was enhanced at 32°C revealing that FAR10 may be an inhibitor of mitotic exit.

Overexpression of FAR10 causes synthetic dosage effects in mutants that are defective in Clb-CDK inactivation such as hct1-?1 and sic1-?1. These results suggest that a defective Clb-CDK inactivation either to due impaired degradation or absence of inhibition by Sic1 makes cells susceptible to Far10 overexpression. In addition, hct1-?1 far10? and sic1-?1 far10? double mutants showed synthetic growth defect at 30°C, which was markedly enhanced at 37°C. The data prove that presence of Far10 is required under these conditions.

The ultimate function of the mitotic exit network in budding yeast is inactivation of the mitotic Clb2-CDK activity, which is followed by cytokinesis resulting in the formation of two daughter cells [Visintin et al., 1998].

In relevance of these findings it was rationalized that an enhancement in Clb-CDK inactivation through ectopic overexpression of Sic1 might alleviate the toxic effects associated with FAR10 overexpression. Henceforth, SIC1(HA)1X was co-overexpressed with FAR10 in cdc23-1, cdc14-3, dbf2-2 and tem1-3 mutants. Results in this case show that co-overexpression of SIC1(HA)1X along with FAR10 did not restore wild type growth rates. An analogous result was obtained when Sic1 was overexpressed in MEN mutants that harbored a deletion of FAR10. The data here propose an ill-defined role for Far10 as an inhibitor of mitotic exit. Additionally, these results also provide evidence that FAR10 may act in parallel to MEN and/or co-operate in triggering exit from mitosis.

Das Ubiquitin-Proteasom System ist verantwortlich für die Regulierung einer Fülle von physiologischen Prozessen in der Zelle. Dazu gehört der gezielte Abbau von verschiedenen zellulären Proteinen, die über Ubiquitinmarkierung für die Proteolyse gekennzeichnet werden. Dieser spezifische regulatorische Mechanismus spielt in vielen grundlegenden Abläufen der Zelle eine bedeutende Rolle [Hilt, 2004]. So reguliert das Ubiquitin-Proteasom-System zum Beispiel Abläufe im Zellzyklus, z.B. bei der Zellteilung oder der Trennung von Mutter und Tochterzelle oder in der Entwicklung der Zelle. Es erfüllt außerdem wichtige Aufgaben in der Stressantwort der Zelle, z.B. durch Anpassung von Rezeptoren an der Zelloberfläche oder der Steuerung der Reparatur von DNA-Schäden. Zu den weiteren Aufgaben gehören die Regulation der Transkription, die Steuerung der Entzündungsreaktion, die Kontrolle der Biosynthese von Organellen in der Zelle. Zu wichtigen, an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligten Substraten des Ubiquitin-Proteasom Systems zählen die Cycline, bestimmte Inhibitoren cyclinabhängiger Kinasen wie Sic1 sowie Regulator und Strukturproteine, die für die Trennung der Schwesterchromatiden und den Aufbau der Mitosespindel verantwortlich sind. Bestimmte Tumorsuppressoren sowie Transkriptionsaktivatoren und Inhibitoren werden auch durch Ubiquitin-abhängige Proteolyse kontrolliert.

Das Ubiquitin-Proteasom-System hat außerdem eine zentrale Bedeutung in der Proteinqualitätskontrolle. Es entfernt gezielt mutierte, falschgefaltete oder denaturierte Proteine. Dazu gehören abnormale Proteine des Zytoplasmas und des Zellkerns sowie geschädigte Proteine aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), die über eine speziellen Rücktransportmechanismus ins Zytoplasma zurückgeschleust und damit dem Abbausystem zugeführt werden . Um zelluläre Funktionen des Ubiquitin-Proteasom Systems weiter aufklären zu können, war es interessant und wichtig, neue Substrate zu identifizieren und zu charakterisieren. Dazu war in einer vorangegangenen Arbeit über eine spezielle genetische Methode nach Proteinen gesucht worden, deren Überexpression in Zellen mit einem Defekt des proteasomalen Abbaus eine Störung des Wachstums oder Letalität erzeugt (HEL-Phänotyp: high expression lethality) [Ledig,1996; Velten, 1996; Velten, 2000]. Die Suche basierte auf folgendem Ansatz: Werden in proteasomalen Mutanten (pre1-1 pre4-1) Proteine überexprimiert, deren Abbau über das Ubiquitin-Proteasom System für das Überleben der Zelle erforderlich ist, so sollte diese angehäuft werden und messbare Wachstumsdefekte auslösen. Mit dieser Methode gelang es, unter anderen ein zu diesem Zeitpunkt unbekanntes Protein zu identifizieren, das alle Bedingungen des Screens erfüllte und zusätzlich Zellzyklus-spezifische Effekte induzierte. Dieses Protein, ursprünglich Hel48 genannt, wird jetzt allgemein in der Literatur als Far10 bezeichnet [Kemp et al., 2001].

Cycloheximid-Chase-Proteolysestudien bestätigten, dass Far10 tatsächlich ein proteasomales Substrat ist. Hierbei wurde der Umsatz von unter ihren endogenen Promotor exprimierten, N-terminal mit einem 19-Myc-Epitop markierten oder C-terminal mit einem HA-Tridem markierten Far10 Versionen verfolgt. Während Far10 in Wildtypzellen bemerkenswert schnell abgebaut werden, erfolgte in proteasomalen Mutanten (pre1-1 pre4-1) eine klare Stabilisierung. Expressions-Untersuchungen der Epitop-markierten Versionen von Far10 hatten ergeben, dass diese wie Wildtypzellen in der Lage sind das Wachstum von Hefezellen zu blockieren. Die Markierung scheint damit keine Beeinträchtigung der Funktion von Far10 auszulösen. Die mit den Epitop-markierten Versionen gewonnen Abbaudaten spiegeln daher mit hoher Wahrscheinlichkeit die normale physiologische Situation wieder.

Proteolyse ist ein zentraler Regulationsmechanismus des Zellzyklus in Eukaryontenzellen. Wichtige Teilschritte wie die Initiation der DNA-Replikation, die Trennung der Schwesterchromatiden und die Kontrolle des Austritt aus der Mitose hängen vom proteolytischen Abbau spezifischer Zielproteine ab [Hershko, 1997; Jan-Michael Peters, 1998; Hilt, 2004]. Die Ubiquitin-Protein Ligase APC (anaphase promoting complex) ist ein essenzieller Proteinkomplex, der für die Ubiquitin-abhängige Proteolyse wichtiger Regulatoren und Strukturkomponenten der Mitose verantwortlich ist. Der in allen Eukaryonten hoch konservierte APC-Komplex besteht in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aus 12 bekannten Untereinheiten [Morgan, 1998; Harper et al., 2002; Jan-Michael Peters, 2002]. Beim dem Metaphase-Anaphase Übergang triggert APC in der Hefe Saccharomyces cerevisiae den proteolytischen Abbau des Anaphaseinhibitorproteins Pds1 [Cohen-Fix, 1996]. Pds1 blockiert bis zu diesem Zeitpunkt Esp1, eine hochspezifische Protease, die die Cohesinkomplexe zwischen den Schwesterchromatiden prozessiert [Uhlmann, 1999] und damit die Auftrennung der Chromosomen ermöglicht. Solange Pds1 vorhanden ist wird die Dissoziation der Chromosomen verhindert und somit auch der Eintritt in die Anaphase blockiert [Michaelis, 1997; Ciosk, 1998; Nasmyth, 1999]. Der Abbau von Pds1 wird durch Aktivieren des APCs durch den Regulator Cdc20 in der Metaphase induziert.

Der Austritt aus der Mitose benötigt die Inaktivierung B-Typ-Cyclin-abhängiger Kinase Komplexe (Clb2-CDKs), die als zentrale Steuereinheiten die einzelnen Zellzyklusphasen definieren. Dazu wird einerseits ein spezifisches Clb-CDK Inhibitorprotein, Sic1, aktiviert, andererseits der Hct1-APC-vermittelte Abbau des Cyclinmoleküls Clb2 in Gang gesetzt. Diese Mechanismen werden durch ein komplexes Signalverarbeitungssystem, das so genannte mitotische Exit Netzwerk (MEN) induziert. Dazu wird das G-Protein Tem1 bei Eintritt des Tochterspindelpolkörpers in die neu generierte Knospe aktiviert. Tem1 löst dann in einer Signalkaskade über Dbf2 die Freisetzung der Phosphatase Cdc14 aus dem Nukleolus aus. An der Signalverarbeitung durch MEN sind zusätzlich Cdc5 und Cdc15 Kinase beteiligt. Freigesetztes Cdc14 stimuliert schließlich die Inaktivierung der CDK Komplexe durch Aktivierung von Hct1 und Sic1. Diese Befunde machten klar, dass Cdc20 und Cdh1 als substratspezifische Aktivatoren des APC den Abbau definierter Zielproteine in zeitlich abgestimmter Reihenfolge während der Mitose steuern.

Überexpressionexperimente hatten gezeigt, dass die Überproduktion von Far10 führte in cdc23-1, cdc20-1 und hct1-?1 Mutanten mehr oder weniger starke Wachstumsdefekte auslöst. Damit war eine Beteiligung des APC-Komplexes beim Abbau von Far10 wahrscheinlich. Cycloheximid-Chase Experimente mit N-terminal 19-Myc markiertem Far10 bestätigten dies: Sowohl in cdc23-1 Mutanten als auch in cdc20-1 Mutanten trat eine fast vollständige Stabilisierung von Far10 auf. Im Gegensatz dazu zeigte die Deletion von HCT1 keinen Effekt. Die Ergebnisse konnten damit bestätigen, dass Far10 spezifisch über den Cdc20-APC-vermittelten Abbauweg degradiert wird.

Alle bisher identifizierten Substratproteine des Cdc20-APC Wegs besitzen ein konserviertes Erkennungsmotiv, die so genannte D-Box („destruction box“). Dieses Motiv besteht aus neun Aminosäuren mit der Konsensussequenz RXXLXXVXN/ D/ E. In der Far 10 Sequenz konnte in der Nähe des C-Terminus Motiv mit ähnlicher Sequenz (340RRKLSGKYE348) entdeckt werden. Zur Kontrolle der Relevanz dieser potenziellen D-Box wurden die beiden ersten Aminosäuren Arginin340/341 des Motivs in Alanin340 sowie Leucin341 mutiert. In einem zweiten Konstrukt wurde auch die Aminosäure Leucin343 an der Position vier des D-Box Motivs durch Alanin ausgetauscht. Entgegen der Erwartung zeigten beide Konstrukte bei Überexpression in Wildtypzellen jedoch keine toxische Wirkung. Abbauexperimente mit einer N-terminal 19-Myc markierten Version des in der potenziellen D-Box mutierten N(Myc)19Far10(L343A) zeigte nach Expression des Konstrukts unter seinem endogenen Promotor in Wildtypzellen normale Degradationsraten. Die Veränderungen in der potenziellen D-Box reichen demnach nicht aus um das Protein zu stabilisieren. Möglicherweise sind andere oder zusätzliche Determinanten des Far10 Proteins als Abbausignal wirksam.

Die Sequenzanalyse ergab außerdem dass FAR10 neben einer N-terminalen FHA Domäne (fork head associated; diesen wird eine Funktion in der Vermittlung durch Phosphorylierung getriggerter Protein-Protein-Interaktionen zugeschrieben [Li et al., 2000; Durocher and Jackson, 2002] eine C-terminale Transmembrandomäne besitzt. Fraktionierungsexperimente sowie immunofluoreszenzmikroskopische Untersuchungen lokalisierten Far10 an der Kernhülle [Velten, 2000]. Um die Funktion der C-terminalen Transmembrandomäne zu untersuchen, wurde ein Far10 Deletionskonstrukt generiert, bei dem die Transmembrandomäne fehlt. Im Gegensatz zu Far10 Wildtypprotein konnte die verkürzte Version Far10?TM bei Überexpression in pre1-1 pre4-1, cdc23-1 und cdc20-1 Mutanten keine toxischen Effekte auslösen. Immunofluoreszenzexperimente zeigten, dass das mutierte Protein nicht mehr korrekt platziert wird. Daraus kann geschlossen werden, dass die Lokalisierung von Far10 an der nukleären Membran zur Ausführung seiner inhibitorischen Funktion notwendig ist.

Zur weiteren Aufklärung der funktionellen Wechselwirkung von Far10 mit den regulatorischen Komponenten des den Austritt aus der Mitose steuernden MEN Netzwerks wurde ein genetischer Ansatz verwendet. Dazu wurde die Auswirkungen der Überexpression und Deletion von FAR10 in Mutanten mit Defekten im MEN-Netzwerk als auch in Mutanten gestörter Clb2-CDK Inaktivierung untersucht.

Die Überexpression von Far10 löste bei einer Reihe von MEN Mutanten, speziell in tem1-3, dbf2-2, cdc14-3, Mutanten stark toxische Effekte aus. In cdc15-2 und cdc5-1 Mutanten konnten schwache und in lte1? and mcd1 Mutanten keine Effekte gefunden werden. Das heißt wenn MEN inaktiv ist, die Zelle sich sozusagen in einem antiproliferativen Status befindet, wirkt sich der inhibitorische Effekt von überexprimiertem Far10 besonders stark aus. Im Gegensatz dazu wird bei einer Hyperaktivierung des MEN-Wegs, das heißt wenn die Zelle proaktive Signale zur Beendigung der Mitose empfängt, der Far10 Effekt teilweise überdeckt. Zellen mit einer Bub2 Deletion, bei denen Tem1 nicht mehr korrekt in den inaktiven Zustand überführt werden kann, zeigten bei Überexpression von Far10 im Vergleich zu Wildtyp Zellen verbessertes Wachstum. Zusätzlich wurde in MEN Mutanten bei Abwesenheit von Far10 (far10? Deletionsmutante) eine Verbesserung des Wachstums beobachtet. Das heißt, der antiproliferative Effekt einer fehlenden Aktivierung von MEN ist zumindest teilweise von der Anwesenheit von Far10 abhängig. Diese Ergebnisse werden am besten durch die Annahme erklärt, dass MEN und Far10 Mitglieder von zwei unterschiedlichen Prozessen sind, die parallel, redundant oder gemeinschaftlich den Austritt aus der Mitose steuern.

Um die funktionelle Verbindung zwischen Far10 und der Inaktivierung der Clb-CDKs am Ende der Mitose weiter zu untermauern, wurde die Auswirkung der FAR10 Überexpression und Deletion auf Zellen, in denen die CDK-Inaktivierung direkt gestört ist, untersucht. Dazu wurde Far10 sowohl in sic1? Mutanten, sowie auch hct1 Knock-out-Zellen überexprimiert bzw. deletiert. In beiden Fällen wurden signifikante Wachstumsdefekte (synthetische Dosierungsdefekte, synthetische Letalität) beobachtet. Bei partiell gestörter Clb2-CDK Inaktivierung ist offensichtlich das Vorhandensein von Far10 in der richtigen Konzentration notwendig; beziehungsweise wird bei nicht-physiologischer Expression von Far10 eine perfekte Clb2-CDK Inaktivierung am Ende der Mitose benötigt. Diese Ansicht wurde durch Experimente, bei denen die Störung der Clb2-CDK Inaktivierung durch Überexpression des Clb2-CDK-Inhibitorproteins Sic1 (partiell) ausgeglichen war, bestätigt. Zellen, mit nicht-abbaubarem Clb2 können bei Sic1 Überexpression normal wachsen. Entsprechend wird ein Defekt der MEN-Aktivierung in cdc14 oder tem1 Mutanten durch eine verstärkte Sic1 Expression überdeckt. Die durch Hyperaktivierung von Far1, bzw. dessen Abwesenheit ausgelösten Defekte konnten aber durch eine verstärkte Expression von Sic1 nicht vollständig kompensiert werden. Wird Far10 nicht oder in zu hoher Menge produziert, benötigt die Zelle für ihr Wachstum offensichtlich den perfekt ausbalancierten Mechanismus der natürlichen Clb2-CDK Inaktivierung.

Zusammengefasst zeigen die hier vorgelegten Daten, dass Far1 offensichtlich eine Komponente ist, die kooperativ zu den zentralen Taktgebern der Mitose, den Cyclin-abhängigen Kinase Komplexen eine wichtige Rolle in der Kontrolle des mitotischen Exits spielt. Sein proteolytischer Abbau via Cdc20-APC ist dabei offensichtlich ein wichtiges regulatorisches Moment.