Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-8157
Authors: Gutekunst, Matthias
Title: Chemosensitivity of testicular germ cell tumors is based on high constitutive Noxa protein levels and a functional p53 response
Other Titles: Die Chemosensitivität testikulärer Keimzelltumore basiert auf konstitutiv hohen Noxa Protein Levels und einer funktionellen p53 Aktivierung
Issue Date: 2013
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-85822
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/8174
http://dx.doi.org/10.18419/opus-8157
Abstract: In contrast to the majority of tumors, testicular germ cell tumors (TGCTs) can be cured by chemotherapy even in advanced metastatic stages. Thus, these neoplasms are considered a paradigm of chemosensitive tumors. It is well accepted that their intrinsic susceptibility to apoptosis determines the unique responsiveness to Cisplatin-based chemotherapy. Although p53 has been implicated in the chemotherapeutic response of TGCTs, the role of this tumor suppressor remains controversial to date. In this study, RNAi-mediated silencing of p53 is shown to completely abrogate Cisplatin hypersensitivity of TGCTs. The central role of p53 is further demonstrated by the finding that the amount of p53 protein induced by Cisplatin treatment is tightly correlated with apoptosis induction. In this context, a reduced capacity to repair damaged DNA is rather unlikely to account for hypersensitivity, a conjecture that is strengthened by the finding that TGCT cells are capable of removing Cisplatin adducts from DNA if apoptosis induction is blocked by caspase inhibition. On the contrary, the hypersensitive phenotype is a result of the unique responsiveness of TGCTs to p53 activation in general, since treatment with the nongenotoxic p53 activators Nutlin-3 or Bortezomib leads to p53-dependent apoptosis to a similar extent as does Cisplatin treatment. Although functional p53 is a mandatory requirement for Cisplatin hypersensitivity in TGCTs, the proapoptotic character of the p53 response is dependent on the pluripotent cellular context of TGCTs mediated by Oct-4. Differentiation or silencing of Oct-4 expression abrogates Cisplatin sensitivity and reduces apoptosis induction by Nutlin-3 treatment. This is not due to differential activation of p53 since no substantial alterations in Cisplatin-induced target gene activation are observed. Furthermore, p53 accumulation is unaffected by differentiation or Oct-4 depletion. Rather, examination of the Bcl-2 family profile in pluripotent vs. differentiated or Oct-4-depleted cells revealed that high constitutive Noxa protein levels dictate an extremely low apoptotic threshold in TGCT cells. Oct-4 status and Noxa protein levels are correlated to Cisplatin sensitivity in a panel of TGCT cell lines as well as in TGCT patient samples. Importantly, this correlation is also seen with other genotoxic agents such as Etoposide or Doxorubicin and the non-genotoxic p53 activator Nutlin-3. Since Oct-4 depletion leads to a concomitant loss of Noxa protein and NOXA/PMAIP1 transcript, an Oct-4-dependent transcriptional mechanism might account for the high Noxa protein levels. RNAi experiments show that Puma is another important determinant of TGCT hypersensitivity. In contrast to Noxa, Puma is not present at high levels in TGCT cells but exerts its proapoptotic function upon activation by p53. In conclusion, this study demonstrates that pluripotent TGCTs are primed for apoptosis by Oct-4-mediated high constitutive Noxa protein levels. Thus, in response to genotoxic or other stresses p53 activation results in an efficient induction of apoptosis mediated by transcriptional target genes such as PUMA/BBC3.
Testikuläre Keimzelltumore können im Gegensatz zu vielen anderen Tumorerkrankungen selbst im fortgeschrittenen Stadium nach Metastasierung erfolgreich behandelt werden und werden daher als Modellbeispiel chemosensitiver Tumore betrachtet. Es ist allgemein anerkannt, dass die intrinsische Suszeptibilität dieser Tumore für apoptotischen Zelltod deren einzigartiges Ansprechen auf Cisplatin basierte Chemotherapie bestimmt. Obwohl eine prominente Rolle des Tumorsuppressors p53 in der Chemosensitivität testikulärer Keimzelltumore bereits vermutet wurde, konnte dessen Bedeutung bisher nicht zweifelsfrei geklärt werden. In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels RNAi basiertem Gen-Silencing zu zeigen, dass p53 für die Cisplatin Sensitivität dieser Tumore unabdingbar ist. Die zentrale Rolle von p53 wird weiterhin durch die Beobachtung gestärkt, dass die durch Cisplatin induzierte Menge an p53 Protein direkt mit dem Ausmaß an Apoptose korreliert. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine verminderte DNA Reparatur Kapazität keine Rolle für die exklusive Cisplatin Sensitivität testikulärer Keimzelltumore spielt. Dies wird dadurch bestätigt, dass eine Reparatur der durch Cisplatin Behandlung entstandenen DNA Addukte festgestellt werden konnte, wenn die Induktion von Zelltod durch einen Caspase Inhibitor blockiert wurde. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass der hypersensitive Phänotyp auf einer allgemeinen Sensitivität testikulärer Keimzelltumore gegenüber der Aktivierung von p53 basiert. Eine Behandlung mit den nicht genotoxischen p53 Aktivatoren Nutlin-3 und Bortezomib induzierte Zelltod in ähnlichem Maße wie eine Cisplatin Behandlung. Obwohl p53 obligatorisch für die Cisplatin Sensitivität testikulärer Keimzelltumore ist, ist der vorwiegend proapoptotische Charakter der zellulären p53 Antwort durch den pluripotenten zellulären Kontext bedingt, welcher u.a. durch Oct-4 bestimmt wird. Differenzierung bzw. Silencing von Oct-4 führt zu einer substanziellen Reduktion sowohl der Cisplatin Sensitivität als auch der Nutlin-3 Sensitivität. Dies ist nicht auf eine differentielle Aktivierung von p53 zurückzuführen, da keine signifikanten Unterschiede in der Aktivierung von p53 Zielgenen in Oct-4 positiven und Oct-4 negativen Zellen zu beobachten war. Darüber hinaus konnte kein Einfluss auf die Akkumulation von p53 festgestellt werden. Stattdessen ergab eine Untersuchung von Proteinen der Bcl-2 Familie, dass hohe konstitutive Noxa Protein Level zu einer erheblichen Verringerung der apoptotischen Schwelle führen. Sowohl in Zelllinien testikulärer Keimzelltumore als auch in primärem Tumormaterial wurde eine sehr enge Korrelation zwischen Oct-4 Status, Noxa Protein Level und Cisplatin Sensitivität beobachtet. Darüber hinaus ist dieser Zusammenhang sowohl für andere genotoxische Substanzen wie Etoposid und Doxorubicin, als auch für nicht genotoxische Substanzen wie Nutlin-3 gegeben. Die Tatsache, dass der Verlust von Oct-4 außer zu einer Reduktion von Noxa Protein auch zur Verringerung des entsprechenden Transkripts führt weist darauf hin, dass es sich um eine transkriptionelle Art der Regulation handeln könnte. Außerdem wurde Puma als wichtiger Faktor in der Cisplatin Sensitivität testikulärer Keimzelltumore identifiziert. Diese Tumore weisen jedoch keine konstitutiv hohen Puma Protein Level auf. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass Puma seine proapoptotische Funktion nach Aktivierung durch p53 ausübt. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Suszeptibilität pluripotenter testikulärer Keimzelltumore gegenüber Apoptose auf konstitutiv hohe Noxa Protein Level zurückzuführen ist. Aus diesem Grund führt eine Aktivierung von p53 durch zellulären Stress genotoxischer oder nicht genotoxischer Art zu einer effizienten Induktion von Zelltod, welche durch p53 Zielgene wie z.B. PUMA/BBC3 vermittelt wird.
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