Ein GFP-basierter in-vivo-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nach Hydrolaseaktivität

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effektives intrazelluläres Testsystem zur Identifizierung von Hydrolaseaktivität entwickelt. Die Grundlage dieses in vivo Assays beruht auf dem Auftreten von pH-Änderungen bei Hydrolase-katalysierten Substratspaltungen. Ratiometrisches pHluorin, eine pH-sensitive Mutante von Green Fluorescent Protein (GFP) fungierte als Detektor zur Bestimmung dieser pH-Änderungen. pHluorin besitzt im Gegensatz zu GFP zwei pH-abhängige Peaks bei 395 bzw. 475 nm, deren Maxima sich innerhalb eines pH-Bereichs von 8,0 bis 5,5 reversibel zueinander verschieben. Das aus den beiden Peaks gebildete Fluoreszenzemissionsverhältnis R475/395 kann - gemessen bei einer maximalen Emission bei 508 nm - direkt als Maß für intrazelluläre pH-Änderungen herangezogen werden. Die praktische Anwendung dieses Prinzips wurde zunächst durch Koexpression von pHluorin und der Esterase aus Geobacillus stearothermophilus (BSE) als Modellhydrolase in Escherichia coli (E. coli) Zellen und anschließender Hydrolyse verschiedener Ester untersucht. So zeigten Zellen nach Expression von pHluorin und Esterase, in Abhängigkeit von der Enzymaktivität gegenüber den untersuchten Substraten eine mehr oder weniger starke Änderung des Fluoreszenzemissionsverhältnisses. Daraufhin konnte die Anwendung des Assays auch erfolgreich auf Hydantoinase- sowie Amidase-katalysierte Substrathydrolysen erweitert werden. Außerdem wurden verschiedende Experimente im Mikrotiterplattenformat sowie in der Durchflusszytometrie im Hinblick auf eine erfolgreiche Assayapplikation im Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Enzymbibliotheken durchgeführt. Zur Etablierung im Hochdurchsatz-Screening wurde mittels error-prone PCR eine Mutantentenbibliothek der Esterase I aus Pseudomonas fluorescens (PFE I) aufgebaut und mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Nachweissystems auf erhöhte hydrolytische Enzymaktivität gegenüber g-Butyrolacton (GBL) untersucht. Auf diese Weise wurde eine Mutante mit einer 5,6-fach gesteigerten Umsatzrate von GBL im Vergleich zum PFE I-Wildtyp gefunden. Somit konnte gezeigt werden, daß eine schnelle und zuverlässige Untersuchung von Biokatalysatoren bei Anwendung des pHluorin-Assays zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken möglich ist.

In this work an assay sensitive for screening of all types of hydrolase-catalyzed reactions has been developed. This in vivo assay is based on the detection of a change in pH during enzymatic hydrolysis. The strength of this pH change depends on the hydrolase activity. pHluorin, a pH-sensitive mutant of green fluorescent protein (GFP) isolated from Aequorea victoria, was used as a sensor for determination of intracellular pH changes. pHluorin has two pH-dependent excitation maxima, at 395 and 475 nm. A pH decline results in a decrease of the peak at 395 nm and a simultaneous increase of the peak at 475 nm. The ratio of both maxima, the so-called fluorescence emission ratio, acts as an indicator for pH changes, thus facilitating easy monitoring of the intracellular pH value within the range of pH 5.5 - 8.0. The significant advantage of the fluorescence emission ratio for detection of pH changes is its independence of the expression level of pHluorin that is of course inconstant for different cells within a culture. To demonstrate the applicability of this assay principle the emission ratio during conversion of different substrates in E. coli cells producing pHluorin and the Geobacillus stearothermophilus (G. stearothermophilus) esterase was determined. A significant increase in the fluorescence emission ratio was only observed in dependence of the enzyme activity toward the tested carboxylic ester substrates. These results were confirmed by in vitro activity measurements using pH-stat. After these promising results the assay was also successfully applied toward other hydrolase-catalyzed reactions, e. g. the hydrolysis of hydantoin to N-carbamoyl glycine catalyzed by the Arthrobacter crystallopoietes hydantoinase (ACH) and carboxylic acid amide cleavage to the corresponding carboxylic acid and the amine catalyzed by the Bacillus subtilis p-nitrobenzyl esterase (BsubpNBE). In terms of the suitability of the assay for high-throughput screening, several experiments were successfully performed for downscaling to microtiter-plate scale and single cell sorting in flow-cytometric devices. Finally, to demonstrate the applicability of the pHluorin assay for intracellular high-throughput screening in microtiter-plate scale, a mutant library of 3200 clones of the Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) was built up by using error-prone PCR. The screening for enzyme variants with improved activity toward the hydrolysis of γ-butyro lactone (GBL) to γ-hydroxy butyrate (GHB) was used as model problem. During the screening process, twelve clones with a significant higher fluorescence emission ratio compared to the PFE wild-type were selected and characterized by sequencing and activity tests using pH-stat and HPLC. Finally, one mutant showed a 5.6-fold higher activity toward GBL compared to the PFE I wild-type. As a conclusion, a novel pHluorin-based assay was developed and successfully tested on different esterases as well as on a hydantoinase. The assay is based on intracellular pH shifts and hence might be applied for the monitoring of any hydrolytic reaction. This in vivo assay allows detection of pH changes in single E. coli cells, producing recombinant hydrolases. Therefore it can be used not only in microtiter-plate scale but also in combination with flow cytometric systems. For final validation the pHluorin assay was successfully used to screen an enzyme library in microtiter-plate scale, obtaining a mutant with a 5.6-fold higher activity toward the hydrolysis of γ-butyro lactone compared to the PFE wild-type.