Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology

Abstract

Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals.

In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.

Das Auftreten von Resistenzen gegen Beta-Laktam Antibiotika ist ein Problem von zunehmender Bedeutung weltweit. Das Vorkommen von Beta-Laktamasen mit erweitertem Wirkungsspektrum (Extended Spectrum Beta-Lactamases, ESBL) ist hierbei besonders problematisch. ESBLs treten in vielen verschiedenen Spezies der Gattung Enterobacteriacae auf. Die am häufigsten vertretenen Enzyme dieser Art in klinischen Isolaten sind Varianten von TEM-1 oder SHV-1 Beta-Laktamasen. Aufgrund von Aminosäureaustauschmutationen, die zu einer Erweiterung des Substratspektrums führen, vermitteln diese Enzyme auch Resistenzen gegen neuere Generationen der Beta-Laktam Antibiotika (besonders Cephalosporine der 3. und 4. Gruppe). Es treten auch Varianten der TEM- oder SHV-Familie auf, die Resistenzen gegen Inhibitoren (z. B. Clavulansäure) vermitteln. Diese Enzyme werden als IRTs (ursprünglich für Inhibitor Resistant TEM) bezeichnet. Da die einzelnen ESBL Enzymvarianten stark unterschiedliche Substratspektren aufweisen, ist ihr Nachweis mit herkömmlichen phänotypischen Screening-Methoden schwierig. Um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse des ESBL Screenings zu erhöhen, ist die Durchführung von zusätzlichen phänotypischen Tests zur Bestätigung des ESBL-Verdachts unerlässlich. Es kann daher bis zu drei Tagen dauern, bis der Verdacht auf eine Infektion mit einem ESBL-produzierenden Organismus bestätigt wird. Solche Infektionen werden mit längeren Krankenhausaufenthalten und höheren Behandlungskosten in Verbindung gebracht. Daher ist die Entwicklung präziserer und schnellerer Testmethoden zum Nachweis dieser Resistenzen notwendig. Die Mikroarray Technologie erlaubt die genotypische Identifizierung von Resistenzen in einer Analysezeit von weniger als einem Tag. Hierbei können, im Gegensatz zur phänotypischen Diagnostik und auch zu vielen anderen genotypischen Nachweisverfahren, alle relevanten Mutationspositionen erkannt und somit auch verschiedene ESBL-Typen differenziert nachgewiesen werden. Für viele ESBL-Varianten wurde bereits ein spezifisches Substratspektrum definiert, welches nach der eindeutigen Identifizierung auf der molekularen Ebene zu Rate gezogen werden kann, um eine spezialisierte, prediktive Diagnostik zu ermöglichen. Weiterhin kann die genotypische Identifizierung, im Gegensatz zum phänotypischen Nachweis, für eine zuverlässige Überwachung der Verbreitung bestimmter Resistenzmerkmale oder multiresistenter Bakterien im klinischen Umfeld eingesetzt werden.

In dieser Arbeit wurde ein diagnostischer Mikroarray entwickelt für den schnellen und spezifischen Nachweis der Mutationen der TEM und SHV Beta-Laktamase Varianten, die verantwortlich für die Ausprägung eines ESBL oder IRT Phänotyps sind. Die Allel-spezifische Hybridisierung auf dem DNS-Mikroarray erlaubt den Nachweis von 41 Mutationspositionen der TEM Beta-Laktamase Familie (entspricht 99 % der veröffentlichten Positionen) und 37 Mutationspositionen (entspricht 100 % der veröffentlichten Positionen) relevant für SHV. Dies ermöglicht die Identifizierung von 96 % der bis jetzt bekannten TEM Varianten und 100 % der SHV Varianten. Die Vervielfältigung der Resistenzgene erfolgte per PCR über Konsensus-Primer. Die Sensitivität, Reproduzierbarkeit und die Spezifität der Identifizierung der unterschiedlichen Varianten wurde anhand der Mikroarrayanalyse von Referenzstämmen nachgewiesen. Weiterhin wurde der TEM-Array durch die Analyse von 72 klinischen Isolaten, die aus unterschiedlichen Institutionen in Deutschland, Kroatien und Russland stammten, validiert. Der SHV-Array wurde mit 30 klinischen Isolaten aus Kroatien getestet. Der Nachweis von zwei Varianten der gleichen Laktamase-Familie innerhalb eines Isolats, wurde für TEM in einem Modell-System bis zu einem Verhältnis von 1 zu 10 und für SHV in realen klinischen Proben gezeigt. Die Mikroarrayanalyse konnte nach der DNS-Isolation innerhalb von 3.5 Stunden durchgeführt werden. Die Sensitivität und die Reproduzierbarkeit der Analyse wurden durch Automatisierung der Hybridisierung und des Waschvorgangs gesteigert. Die Entwicklung eines marktreifen Systems aus den in dieser Studie entwickelten Prototypen, sowie die Ergänzung der bisher entwickelten TEM und SHV-Arrays zu einem Komplettsystem zum Nachweis aller Merkmale klinisch relevanter Laktamasefamilien ist derzeit in Arbeit. Die hier entwickelten DNS-Mikroarrays stellen ein viel versprechendes System zur schnellen Identifizierung von TEM und SHV ESBL und IRT Varianten dar und ermöglichen die Überwachung der Verbreitung dieser Resistenzen im klinischen Umfeld.