Das Kinetochorprotein Slk19 : Funktion und Interaktion mit der proteasomalen Untereinheit Pre4

Abstract

In dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen Slk19 und Pre4 durch biochemische und genetische Experimente zu untermauern und die Bedeutung dieser Wechselwirkung näher zu untersuchen. In einem genetischen Ansatz wurde versucht, mutierte pre4 Allele zu isolieren, bei denen die mögliche Wechselwirkung zwischen Pre4 und Slk19 blockiert ist. Dafür wurde der Effekt der synthetischen Letalität, der bei der Kombination von SLK19 Deletion mit der KAR3 Deletion auftritt, ausgenutzt. Tatsächlich konnte in einem Klon durch ein pre4 Mutantenallel (pre4-72), das durch mutagene PCR erzeugt worden war, Letalität hervorgerufen werden, die nur in Kombination mit der Deletion von KAR3 auftrat. Dieses Verhalten konnte durch Plasmidaustausch (Umschalten von PRE4 Wildtyp nach pre4-72) in KAR3 Wildtyp Zellen und kar3 Nullmutanten verifiziert werden. Die Analyse der pre4-72 Sequenz ergab drei Punktmutationen im PRE4 ORF. Davon liegt eine N20K (Position 20 der Pro-Sequenz von Pre4) in dem durch Prozessierung entfernten N-terminalen Bereich; zwei Mutationen M52L und M142K verbleiben in der prozessierten Form von Pre4. Untersuchungen zur Lokalisierung der Punktmutationen von prozessiertem Pre4 im Proteasomenkomplex unter Verwendung von Röntgenstrukturdaten des 20S Proteasoms zeigten, dass sich die beiden Mutationen M52L und M142K in Furchen bzw. Taschen des Proteasomenkomplexes befinden und somit in Strukturen, die potentiell der Interaktion mit Slk19 zugänglich sind. Messungen der proteolytischen Aktivität des Proteasoms in pre4-72 Mutanten zeigten gegenüber pre4-1 Mutanten keinen Defekt in der PGPH Aktivität. Aus Experimenten in denen die einzelnen Punktmutationen von pre4-72 getrennt kontrolliert wurden, ging hervor, dass der synthetisch letale Effekt erst durch Kombination beider Punktmutationen M52L bzw. M142K hervorgerufen wurde; bei der Kombination der Einzelmutationen mit kar3D und als Kontrolle mit KAR3 Wildtypzellen traten lediglich von Kar3 unabhängige Wachstumsdefekte auf. Die Untersuchung der Einzelmutanten zeigte außerdem, dass das generelle Kar3 unabhängig auftretende Wachstumsdefizit von pre4-72 Mutanten durch die Punktmutation M142K ausgelöst wird. Bei „Two-Hybrid“-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass bei mutiertem Pre4-72 Protein tatsächlich die Wechselwirkung zu Slk19 stark beeinträchtigt oder blockiert ist. Damit konnte ein weiterer Beweis für die direkte Wechselwirkung zwischen Slk19 und Pre4 erbracht werden. In Zellen mit pre4-72 Hintergrund wurden außerdem phänotypische Untersuchungen zu möglichen Störungen der Mitose und Meiose durchgeführt. Im Gegensatz zu slk19 Nullmutanten konnte für pre4-72 Zellen keine oder wenn überhaupt nur eine nicht signifikant erhöhte Rate der Bildung von Dyaden anstatt Tetraden in der Meiose nachgewiesen werden. Bei Untersuchungen zur Stabilität von artifiziellen Chromosomen war im Gegensatz zu slk19 Nullmutanten in pre4-72 Mutanten nur ein schwach erhöhter aber dennoch signifikanter Verlust an artifiziellen Chromosomen im Verlauf der mitotischen Teilung festzustellen. Aber zumindest übt pre4-72 einen negativen Einfluss auf das Wachstum von Hefezellen aus. Plasmidabhängige pre4-72 Zellen wachsen deutlich langsamer als Wildtypzellen. Beim Versuch der Integration des pre4-72 Allels an den chromosomalen PRE4-Lokus konnten mit verschiedenen Strategien nur Zellen erhalten werden, bei denen die PRE4 Wildtyp Sequenz wiederhergestellt war. Dieses Phänomen ist ein starkes Indiz dafür, dass chromosomal integriertes pre4-72 offensichtlich drastische Nachteile für die Zelle hervorruft.

Immunopräzipitationsexperimente zur Klärung der Frage, ob Slk19 nur mit Pre4 oder dem gesamten Proteasomenkomplex interagiert, hatten in vorangegangenen Arbeiten keine eindeutigen Ergebnisse erbracht. Zur Klärung dieses Problems sollten deshalb Co-Immunopräzipitationsversuche mit HA-markiertem Slk19 nun unter Verwendung von Protein-A-markiertem Pre6 durchgeführt werden, um einen biochemischen Nachweis für die direkte Wechselwirkung von Slk19 mit dem Proteasom zu erhalten. Im Immunopräzipitat von 20S Proteasomen aus nativen Extrakten synchronisierter Zellen unter Verwendung von Pre6-ProtA als antigene Determinante war es möglich, Slk19(HA)3 Signale nachzuweisen. Dieses Ergebnis zeigt, dass Slk19 mit dem Proteasom interagiert. Eine erste Analyse der gefundenen Slk19(HA)3 Signale mit den im Verlauf des Zellzyklus wechselnden Modifikationen von Slk19(HA)3 in durch alkalische Lyse erhaltenen Extrakten lassen zumindest annehmen, dass die Wechselwirkung zwischen Slk19 und dem Proteasom zellzyklus-abhängig reguliert ist. Diese Arbeit konnte einerseits das Modell, dass Slk19 mit dem Proteasomenkomplex interagiert bestätigen. Andererseits weisen die Ergebnisse auf eine Funktion der Wechselwirkung zwischen Slk19 und Pre4 hin, die unabhängig von bekannten Funktionen von Slk19 ist, aber trotzdem während der Mitose und Meiose eine Rolle spielt.

The aim of this work was to confirm the interaction between Slk19 and Pre4 by genetic as well as biochemical means and to analyse the function of Pre4-Slk19 interaction in more detail. A genetic approach was used to isolate mutant pre4 alleles that cause neutralization of the Slk19-Pre4 interaction. For this purpose the known synthetic lethal effect induced by deletion of SLK19 in kar3 null mutants was used. If Slk19-Pre4 interaction was crucial for the essential function of Slk19 in cells lacking Kar3, it should be possible to isolate mutated pre4 alleles that like slk19D cause synthetic lethality in kar3D background. Using this strategy in fact a mutated pre4 allel (pre4-72) was identified, that showed synthetic lethality specifically in combination with the deletion of KAR3. This finding provided an additional, important proof for the Pre4-Slk19 interaction. Analysis of the pre4-72 sequence uncovered three point mutations in the ORF of PRE4. One mutation N20K located in the N-terminal region of Pre4, which is removed during assembly of the proteasome by processing. The other two mutations M52L and M142K remain in the mature form of Pre4. By using x-ray structure data of the 20S proteasom complex both point mutations M52L and M142K were located in furrows/pockets at the proteasomal surface. These findings demonstrate the accessibility of this positions in domains of Pre4, which potentially allow interaction with Slk19. In contrast to pre4-1 mutants, which show a strong defect in proteasomal PGPH activity, pre4-72 mutants exhibited normal PGPH activity. This result indicated, that the synthetic effects induced by combination of pre4-72 and kar3D was based on the interruption of Pre4-Slk19 interaction but not due to a defect of the proteolytic activity of the proteasome. The point mutations present in pre4-72 were separated and individually checked for their ability to cause synthetic effects with kar3D. In any case no synthetic defects were measured indicating that the combination of both point mutations M52L and M142K is required to induce synthetic lethality in cells lacking Kar3. However, analysis of the separated point mutations uncovered, that the general growth defect of pre4-72 mutants is mainly based on the point mutation M142K. To confirm the loss of Pre4-Slk19 interaction in pre4-72 mutants a two hybrid test was performed using Slk19 and Pre4-72. This test clearly prooved that Slk19-Pre4 interaction is abolished for mutant Pre4-72 protein. Cells containing pre4-72 alleles were also investigated for potential defects in meiosis or mitosis cellc cycle phenotypes. In contrast to null mutants of SLK19 pre4-72 cells did not show enhanced formation of dyades instead of tetrades during meiosis. Unlike slk19 null mutants monitoring the stability of artifical chromosomes (YACS) in pre4-72 mutants displayed only slightly increased loss of artificial chromosomes in progression of mitotic division cycle. But at least the pre4-72 allel beares a negative influence on the growth of yeast cells. Attemps of chromosomal integration of pre4-72 at the PRE4-locus resulted in recovery of the PRE4 wildtype sequence. This finding suggests, that as compared with wildtype allels chromosomally encoded pre4-72 mutants are dramatically disadvantaged. Former immunoprecipitation experiments, could not clarify the question whether Slk19 interacts only with Pre4 or with the whole 20S proteasome complex. Therefore co-immunoprecipitation experiments with HA-epitope tagged Slk19 now using protein-A-tagged Pre6 were carried out. Immunoprecipitations of 20S proteasomes from native extracts of synchronised cells, using Pre6-ProtA as the anti-genetic determinant resulted in the detection of Slk19(HA)3 signals indicating the interaction between Slk19 and the proteasome complex. Comparison of the Slk19(HA)3 signals detected with the modified versions of Slk19(HA)3, found in different phases of the cell cycle lead to the suggestion, that interaction between Slk19 and the proteasome is regulated in a cell cycle dependent manner.

The summarised results of this work confirm the model, that Slk19 interacts with the proteasomal complex. The findings in addition point out that the function of Slk19-Pre4 interaction is required for crucial cell cycle events.