Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-851
Authors: Xiao, Li
Title: Protein quality control and degradation of the Endoplasmic Reticulum : elucidation of components and mechanisms of the retrotranslocation system
Other Titles: Proteinqualitätskontrolle des endoplasmatischen Retikulums : Aufklärung der Komponenten und Mechanismen des Retrotranslokationsystems
Issue Date: 2006
metadata.ubs.publikation.typ: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-27784
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/868
http://dx.doi.org/10.18419/opus-851
Abstract: The endoplasmic reticulum (ER) is an intracellular membranous system of all eukaryotic cells where most of the secretory proteins acquire their native tertiary structure. The ER contains a highly active quality control system. Malfolded proteins are selectively recognized in the ER and transported back to the cytoplasm, where they are finally degraded by the 26S proteasome in an ubiquitin dependent manner. The latter process is known as ER associated degradation (ERAD). Failure of this process leads to formation of protein aggregates and results in impaired cell function. To understand how ERAD related components cooperatively participate in ER degradation and to get a better insight if Sec61p is really the pore-forming unit of the protein retrotranslocon, Blue Native Electrophoresis (BN) and co-immunoprecipitation techniques were applied in this study. To determine the composition of the retrotranslocon and to obtain new information on the entire process involved in ERAD, a series of CPY* fusion protein substrates with special structural characteristics were constructed and investigated. Using Blue Native electrophoresis, a stable Der3-Hrd3p complex was detected. The finding of the Der3-Hrd3p complex together with soluble malfolded substrates as CPY* or CPY*GFP and membrane substrates as CT* or CTG*, indicated that Der3-Hrd3p complex acts as a part of a retrotranslocation machinery. The AAA ATPase Cdc48p was also found in this Der3-Hrd3p complex when using Blue Native electrophoresis, indicating the existence of a Cdc48-Der3-Hrd3p complex. The finding of the interaction between Cdc48 and the Der3-Hrd3p complex by co-immunoprecipitation experiments confirmed this complex composition. Blue Native electrophoresis showed two stable Sec61-Sec62-Sec63p complexes (430kDa and 480kDa), the composition of which did not undergo changes in any of the ERAD mutants, indicating that these might constitute the protein import complex. Further insights into the retrotranslocation process was intended to reach with the help of new ERAD substrate CPY*GAr215, a CPY* derivative containing a long Glycine-Alanine repeat sequence. Previous work by Thomas Bohnacker (Diplomarbeit, Universität Stuttgart, 2004) has indicated that full length CPY*GAr215-HA3 is only "processed". A partial degradation product appeared, displaying a loss of the C-terminal part of the protein. Full length and the intermediates of CPY*GAr215-HA3 were shown here to be glycosylated and located in ER vesicles. It was observed here that there is a slight growth reduction in temperature sensitive Sec61-2 cells overexpressing CPY*GAr215 at 35°C. Sec61p was found to interact with Cdc48p and both, full length and intermediates of CPY*GAr215 by co-immunoprecipitation experiments. Remarkably, Blue Native electrophoresis also indicated the existence of a Sec61-Cdc48-CPY*GAr215 complex in wild type cells. All together, this work suggests the existence of a Sec61-Cdc48-Der3/Hrd3-CPY*GAr215 complex which might form a dynamic retrotranslocon in ER degradation. With the help of biochemical methods, the results in this study show the existence and dynamic changes of Cdc48-Der3-Hrd3-substrate protein complexes. This might constitute at least in part the scaffold of the retrotranslocon. Sec61p, as a pore-forming protein, might be involved in the retrotranslocation process. Cdc48 protein complex might act as a linker between the pore and ubiquitination system, and the proteasome, handing over the ubiquitinated substrates from cytosolic face of the ER to 26S proteasome for final degradation.
Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist ein intrazelluläres Membransystem in eukaryontischen Zellen, in das der Großteil der sekretorischen Proteine importiert wird. Diese Proteine erhalten dort ihre natürliche tertiäre Struktur. Das ER hat ein sehr aktives Qualitätskontrollsystem. Falschgefaltete Proteine werden selektiv im ER erkannt und vom ER Lumen oder der ER Membran zurück ins Zytoplasma transportiert, wo sie dann schließlich vom 26S Proteasom in einem ubiquitinabhängigem Prozess abgebaut werden. Dieser Prozess ist bekannt als ER assoziierte Degradation (ERAD). Fehler in diesem Prozess führen zu Proteinagregation, was schließlich zu einer Beeinträchtigung der Zellfunktionen führt. Eine Fehlfunktion der ER assoziierten Degradation hat mehrere medizinisch wichtige Auswirkungen in menschlichen Zellen. Um zu verstehen, wie ERAD beziehende Komponenten miteinander bei der ER Degradation mitwirken, und um einen besseren Einblick zu bekommen, ob Sec61p wirklich eine porenbildende Einheit des Proteinretrotranslokons ist, wurden Blue Native Elektrophorese (BN) und Coimmunoprezipitationstechniken in dieser Studie angewendet. Um die Zusammensetzung des Retrotranslocons zu bestimmen, als auch um neue Informationen über den gesamten Prozess der im ERAD abläuft zu erhalten, wurden eine Reihe von CPY* Fusionsproteinsubstraten mit speziellen strukturellen Charakteristika konstruiert. Durch den Einsatz von Blue Native Elektrophorese wurde ein stabiler Der3-Hrd3p Komplex detektiert. Die Entdeckung des Der3-Hrd3p Komplexes zusammen mit löslichen falschgefalteten Substraten wie CPY* oder CPY*GFP und Membransubstrate wie CT* oder CTG*, deuten darauf hin dass der Der3-Hrd3p Komplex als ein Teil der Retrotranslokationsmaschinerie dient. Die AAA ATPase Cdc48p wurde in diesem Der3-Hrd3p Komplex durch Blue Native Elektrophorese gefunden, was auf die Existenz eines CDC48-Der3-Hrd3p Komplexes hindeutet. Die Entdeckung einer Interaktion zwischen Cdc48 und des Der3-Hrd3p Komplexes durch Coimmunoprezipitationsexperimenten bestätigte diese Komplex Zusammensetzung. Blue Native Elektrophorese zeigte zwei stabile Sec61-Sec62-Sec63p Komplexe (430kDa und 480kDa), eine Zusammensetzung die keiner Veränderung in irgendeiner der ERAD Mutanten unterlag, was darauf hindeutet dass diese den Proteinimportkomplex bilden. Weitere Einblicke in den Retrotranslokationsprozess wollte man mittels des neuen ERAD Substrates CPY*GAr215, einem CPY* Derivat mit einer langen Glycine-Alanine Wiederholungssequenz, erreichen. Bei frühere Arbeit von Thomas Bohnacker (Diplomarbeit, Universität Stuttgart, 2004) zeigte, dass das gesamte CPY*GAr215-HA3 nur "prozessiert" wird. Ein Zwischenabbauprodukt tauchte auf, was einen Verlust des C-terminalen Teiles des Proteins anzeigt. Das gesamte Protein und auch die Intermediate vom CPY*GAr215-HA3 stellten sich als glycosiliert und in ER Vesikeln lokalisiert heraus. Es zeigte sich durch Coimmunoprezipitationen, dass Sec61p mit Cdc48p interagiert, sowie auch mit dem gesamten Protein und auch den Intermediaten von CPY*GAr215-HA3. Bemerkenswerterweise deutete sich auch durch Blue Native Elektrophorese die Existenz eines Sec61-Cdc48-CPY*GAr215 Komplexes in Wildtypzellen an. Zusammengefasst deutet diese Arbeit auf Existenz eines Sec61-Cdc48-Der3/Hrd3-CPY*GAr215 Komplexes hin, welcher wohl einen dynamisches Retrotranslokon für die ER Degradation bilden kann. Mit der Hilfe von biochemischen Methoden, zeigen die Ergebnisse dieser Studie die Existenz und die dynamischen Veränderungen des Cdc48-Der3-Hrd3-Substrat Protein Komplexes. Dies könnte zu mindest in Teilen das Gerüst des Retrotranslokons darstellen. Sec61p, konnte als ein Porenbildendes Proteien an dem Retrotranslokationsprozess beteiligt sein. Der Cdc48 Proteinkomplex könnte als ein Linker zwischen der Pore, dem Ubiquitinierungssystem und dem Proteasom fungieren, indem es die ubiquitinierten Substrate von der zytosolischen Seite des ERs zum 26S Proteasom zur endgültigen Degradation überreicht.
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