Molecular chaperones in protein quality control : from recognition to degradation

Abstract

The endoplasmic reticulum (ER) harbours a protein quality control system which monitors protein folding in the ER. Elimination of misfolded proteins (called ERAD, ER-associated degradation) is an important function of this protein quality control process. Earlier studies with various soluble and transmembrane (TM) ERAD substrates revealed differences in the ER-degradation machinery used. To unravel the nature of these differences we generated two type I membrane ERAD substrates carrying misfolded carboxypeptidase yscY (CPY*) as the ER-luminal ERAD recognition motif. Whereas the first, CT* (CPY*-TM), has no cytoplasmic domain, the second, CTG*, carries the green fluorescent protein (GFP) present in the cytosol. Together with soluble CPY*, these three substrates represent topologically diverse misfolded proteins, degraded via ERAD. This study shows that degradation of all three proteins is dependent on the ubiquitin-proteasome-system involving the ubiquitin-protein-ligase complex Der3/Hrd1p-Hrd3p, the ubiquitin conjugating enzymes Ubc1p and Ubc7p as well as the AAA-ATPase complex Cdc48-Ufd1-Npl4 and the 26S proteasome. In contrast to soluble CPY*, degradation of the membrane proteins CT* and CTG* does not require the ER proteins Kar2p (BiP) and Der1p. Instead, CTG* degradation requires cytosolic Hsp70, Hsp40 and Hsp104p chaperones and the chaperone activity of Ssa1p is necessary for the dislocation of polyubiquitinated CTG* prior to the action of the Cdc48p-Ufd1p-Npl4p complex. The finding that the chaperone activity of Ssa1p is not limited to ERAD substrates indicates the general importance of this chaperone activity for the elimination of unwanted proteins by the ubiquitin-proteasome system in the cellular context. The mechanism of protein quality control and elimination of misfolded proteins in the cytoplasm is poorly understood. We studied the involvement of cytoplasmic factors required for the degradation of two ER-import defective mutated derivatives of carboxypeptidase yscY, delta-ssCPY* and delta-ssCPY*-GFP, and also examined the requirements for degradation of the corresponding wild type enzyme made ER-import incompetent by removal of its signal sequence (delta-ssCPY). All these protein species are rapidly degraded via the ubiquitin-proteasome system. Degradation requires the ubiquitin conjugating enzymes Ubc4p and Ubc5p, the cytoplasmic Hsp70 Ssa chaperone machinery and the Hsp40 co-chaperone Ydj1p. The Hsp90 chaperones are not involved in the degradation process. Elimination of a GFP fusion (GFP-cODC), containing the C-terminal 37 amino acids of ornithine decarboxylase (cODC) directing this enzyme to the proteasome, is independent of Ssa1p function. Fusion of delta-ssCPY* to GFP-cODC to form delta ssCPY*-GFP-cODC re-initiates a dependency on the Ssa1p chaperone for degradation. Evidently, the misfolded protein domain dictates the route of protein elimination. These data and our further results give evidence that the Ssa1p-Ydj1p machinery recognizes misfolded protein domains, keeps misfolded proteins soluble, solubilizes precipitated protein material, and escorts and delivers ubiquitinated misfolded proteins to the proteasome for degradation.

Das endoplasmatische Retikulum (ER) beherbergt ein Proteinqualitätskontrollsystem, durch das die Proteinfaltung im ER kontrolliert wird. Der Abbau von falschgefalteten Proteinen ist eine wichtige Funktion dieser Proteinqualitätskontrolle. Aus früheren Untersuchungen mit verschiedenen löslichen und membrandurchspannenden Substraten des ERAD (ER-assoziierte Degradation) Signalweges ist bekannt, dass die einzelnen Substrate einen unterschiedlichen Aufbau der ER Degradationsmaschinerie benötigen. Um die Grundlagen dieser Unterschiede zu enträtseln, wurden zwei Typ I membrandurchspannende ERAD Substrate erzeugt, welche die fehlgefaltete Carboxypeptidase yscY (CPY*) als ER lumenales ERAD Erkennungsmotiv besitzen. Das Substrat CT* (CPY*-TM) besitzt keine zytoplasmatische Domäne mehr, wogegen das Substrat CTG* das grünfluoreszierende Protein „GFP“ im Zytosol präsentiert. Zusammen mit dem löslichen CPY* stellen alle drei Substrate hinsichtlich der Topologie unterschiedliche fehlgefaltete Proteine dar, welche über den ERAD Signalweg abgebaut werden. Diese Studie zeigt, dass der Abbau dieser 3 Proteine abhängig vom Ubiquitin-Proteasom System, einschließlich des Ubiquitin-Ligase Komplexes Der3/Hrd1p-Hrd3p, der Ubiquitin konjugierenden Enzymen Ubc1p und Ubc7p, als auch des AAA-ATPase Komplexes Cdc48-Ufd1-Npl4 und des 26S Proteasomes erfolgt. Im Gegensatz zum löslichen CPY*, benötigen die membrangebunden Proteine CT* und CTG* kein Kar2p (BiP) und Der1p, zwei ER lokalisierte Proteine. Stattdessen benötigt CTG* für seinen Abbau die zytosolischen Chaperone Hsp70p, Hsp40p und Hsp104p. Noch vor der Aktivität des Cdc48p-Ufd1p-Npl4p Komplexes benötigt polyubiquitiniertes CTG* für seine Dislokation die Chaperonaktivität von Ssa1p. Die Entdeckung, dass die Funktion von Ssa1p nicht auf ERAD Substrate limitiert ist, zeigt die allgemeine Bedeutung dieses Chaperons für den Abbau von unerwünschten Proteinen durch das Ubiquitin Proteasom system im zellulären Kontext. Über die grundlegenden Mechanismen der Qualitätskontrolle und den Abbau von Proteinen im Zytoplasma ist bisher wenig bekannt. Daher untersuchten wir die Beteiligung von zytoplasmatischen Faktoren, die für den Abbau von delta-ssCPY* und delta-ssCPY*-GFP benötigt werden. delta-ssCPY* und delta-ssCPY*-GFP sind zwei ER-Import- defiziente, mutierte Versionen der Carboxypepdidase Y. Zusätzlich wurden die beteiligten Komponenten für den Abbau des entsprechenden Wildtypenzyms (delta-ssCPY) untersucht, welches durch die Entfernung seiner ER-Signalsequenz ebenfalls importdefizient gemacht wurde. Allen genannten Proteinen ist gemeinsam, dass sie schnell durch das Ubiquitin Proteasom System abgebaut werden. Ihr Abbau erfordert die Ubiquitin konjugierenden Enzyme Ubc4p und Ubc5p, die zytosolische Hsp70 Ssa Chaperon Maschinerie und das Hsp40 Cochaperon Ydj1p. Hsp90 Chaperone sind am Abbauprozess nicht beteiligt. Die Degradation eines GFP Fusionsproteins (GFP-cODC), das die C-terminalen 37 Aminosäuren der Ornithindecarboxylase (cODC) besitzt, wodurch dieses Enzym zum Proteasom geleitet wird, ist unabhängig von der Ssa1p Funktion. Die Fusion von delta-ssCPY* und GFP-cODC zu delta-ssCPY-GFP-cODC löst wiederum die Abhängigkeit von Ssa1p Chaperonen für den Abbau auf. In diesem Zusammenhang prüften wir, ob Mutationen in dem Ubiquitin Modifikationsbereich von SSA1 einen Einfluss auf die Chaperonaktivität beim Abbau von delta-ssCG* haben. Jedoch konnte in den drei mutierten SSA1 Allelen, SSA1K521R, SSA1K536R und SSA1K521R- K536R keine Veränderung des Abbaus von delta-ssCG* gefunden werden. Offenbar schreiben die fehlgefalteten Proteindomänen den Weg zur spezifischen Proteinentfernung vor. Diese Daten und unsere weiteren Ergebnisse liefern Hinweise dafür, dass die Ssa1p-Ydj1p Maschinerie fehlgefaltete Proteindomänen erkennt, fehlgefaltete Proteine löslich hält, bereits präzipitiertes Proteinmaterial wieder in Lösung bringt und fehlgefaltete, ubiquitinierte Proteine zum Proteasom eskortiert und dort zu deren Degradation abliefert.