Metabolic analysis of carotenoid dynamics and global metabolism in carotenoid mutants of Rhodospirillum rubrum using HPLC/MS methodology

Abstract

In this study, Rhodospirillum rubrum, a photosynthetic, facultative anaerobic bacterium was investigated as a potentially good candidate for industrial carotenoid production. Due to its high amounts of intracellular membrane (ICM), it provides more possibilities for the storage of carotenoids than E. coli, where only the cytoplasmic membrane is available for sequestration. Since R. rubrum is an anoxygenic phototrophic bacterium, all photosynthetic operators are consequently regulated by oxygen in contrast to aerobic phototrophic microorganisms. The photosynthetic membrane (PM) and carotenoid biosynthesis can only be induced at low (pO2<0.5%) oxygen concentrations. Despite the detailed characterization of the PM there is a paucity of information regarding the biosynthesis and the assembly of the photosynthetic system. Therefore, the wild-type, ST4 (crtD-) and SLYC18 (crtC-crtD-) carotenoid mutants were studied by rapid sampled anaerobic and microaerophilic, dark fed-batch fermentations using fructose-succinate medium. The roles of the regulatory signals - O2 and ubiquinone (UQ) pool - mediating the metabolic pattern and the induction of PM biosynthesis were also investigated in this study. The metabolic pattern showed that strong oxygen and CO2 limitation resulted in extremely slow growth. High-level organic acid excretion and polyhydroxybutyrate (PHB) biosynthesis were observed, reflecting the fully reduced state of the cell. The metabolic profile, induced by the high intracellular acetate concentrations occurring in the initial phase of the growth curve, indicated that the citramalate and the ethylmalonyl pathways were active under anaerobic conditions. Succinate production, presumably via the methylmalonyl pathway, was also observed in absence of oxygen. SLYC18 was found to grow twice as fast as the wild-type under CO2- and oxygen-limited conditions. Under anaerobic conditions SLYC18 contained a two fold higher level of rhodoquinone-10 (RQ) and PHB than the wild-type. Since the high RQ level and the enhanced PHB production show a strong correlation, it is proposed here that the RQ-mediated production of NADPH occurs via a putative NADPH dehydrogenase. In order to investigate the biosynthesis of the PM, the major lipid fractions (fatty acids, phospholipids), as well as carotenoids, isoprenoid quinones and bacteriochlorophyll a (BChla) were measured simultaneously during the fermentation process. Therefore, a single-step extraction with a ternary hexane/methanol/water mixture followed by HPLC with mass spectrometric detection was developed for determination of carotenoids and other non-polar compounds present. The method is suitable for extracting large numbers of samples, which is common in systems biology studies. The procedure was able to determine 18 carotenoids, 4 isoprenoid-quinones, BChla and bacteriopheophytin a as well as four different phosphatidylglycerol species of different acyl chain compositions. The high-resolution time courses of the carotenoid biosynthesis allowed the conversion rate of each carotenogenic reaction to be studied. A strong bottleneck was observed at the reactions of CrtD. Furthermore, the second reactions of all enzymes are significantly slower than the first one. Analysis of the carotenoid dynamics indicated that several parallel carotenoid pathways can be linked at common connection points (hydroxylated carotenoids). The carotenoid biosynthesis was more strongly affected by the low oxygen concentration than the central metabolic pattern. The carotenoid mutants were the most sensitive to oxygen, resulting in growth inhibition and a 33% decrease of anaerobic carotenoid concentration in SLYC18. The carotenogenic reaction sequence was blocked in the wild-type in the presence of oxygen, which resulted in the accumulation of anhydrorhodovibrin instead of the normal major carotenoid, spirilloxanthin. The presence of oxygen clearly affected the activity of CrtD resulting in the opening of two new side-pathways: the alternative spheroidene pathway (4%) in the wild-type and ST4 and the 3,4-didehydrolycopene pathway (6%) in ST4. The existence of the 3,4-didehydrolycopene pathway, which has never been observed in R. rubrum earlier, indicated the ability of CrtI in catalyzing five desaturation steps in the presence of oxygen in the ST4 mutant. The PM biosynthesis showed a strong dependence on the changes of the [UQ]/[UQH2] ratio. Under anaerobic conditions, the metabolism is sensitive to pulses of oxygen, causing temporary inactivation the oxidative tricarboxylic acid cycle and the electron transport chain and changes in the UQ pool redox state. This oscillation pattern was analyzed by system biological methods. The systems biology analysis suggested that the isoprenoids are regulated by an exogenous signal. Considering the metabolic observations in the experiments, the regulatory signal might possibly be the [UQH2]/[UQ] ratio.

In dieser Arbeit wurde Rhodospirillum rubrum, ein photosynthetisches Bakterium, als Kandidat für industrielle Carotinoid (Crt)-Produktion untersucht. Seine Fähigkeit große Mengen intrazellulärer Membranen (ICM) auszubilden, ermöglicht es R. rubrum mehr Crts zu speichern als E. coli, bei dem nur die Cytoplasmatische Membran zur Verfügung steht. Da R. rubrum ein anoxygenes phototrophes Bakterium ist, werden, im Gegensatz zu den aeroben Mikroorganismen, alle photosynthetischen Gene durch den Sauerstoff-Partialdruck (pO2) reguliert. Nur bei niedrigen O2-Konzentrationen (pO2<0,5 %) kann die Biosynthese der photosynthetischen Membran (PM) und der Crts induziert werden. Über die Biosynthese und die Assemblierung des Photosynthetischen Systems ist noch nicht viel bekannt. So wurden in dieser Arbeit sowohl der Wildtyp als auch die Crt-Mutanten ST4 (crtD-) und SLYC18 (crtC-crtD-) genauer untersucht. Hierbei wurden anaerobe und microaerophile Kulturen aus Fed-Batch Fermentationen im Dunkeln in einem Fructose-Succinat Medium durch schnelles Sampling gewonnen und die Rolle der regulatorischen Signale - O2 und Ubichinon (UQ) Pool, die das Stoffwechselprofil und die Induktion der PM Biosynthese vermitteln - genauer untersucht. Das Stoffwechselprofil zeigte, dass eine große O2 und CO2 Limitierung während der Experimente vorlag, was ein extrem langsames Wachstum zur Folge hatte. Es konnte eine Ausscheidung von organischen Säuren in höheren Mengen und eine erhöhte Polyhydroxybutyrat (PHB) Biosynthese beobachtet werden, was den voll reduzierten Zustand der Zelle reflektierte. Das Stoffwechselprofil, das durch die hohen intrazellulären Acetat-Konzentrationen, die in der Anfangsphase der Wachstumskurve auftraten, induziert wurde, deutete darauf hin, dass der Citramalat und der Ethylmalonyl Stoffwechselweg unter anaeroben Bedingungen aktiv waren. Auch Succinatproduktion, wahrscheinlich durch den Methylmalonyl Stoffwechselweg, wurde in Abwesenheit von O2 beobachtet. SLYC18 wuchs unter O2 und CO2 Limitierung doppelt so schnell wie der Wildtyp. Außerdem enthielt SLYC18 unter anaeroben Bedingungen doppelt so viel Rhodochinon-10 (RQ-10) und PHB wie der Wildtyp. Da die hohen RQ und PHB Werte stark korrelierten, wird hier vorgeschlagen, dass die RQ vermittelte NADPH Produktion über eine putative NADPH Dehydrogenase abläuft. Um die Biosynthese der PM zu untersuchen war es notwendig, die Haupt-Lipidfraktionen, sowie die Crts, Chinone und Bakteriochlorophyll a (BChla) simultan während des Fermentationsprozesses zu messen. Hierfür wurde eine Ein-Schritt-Extraktionsmethode mit einem ternären Hexan/Methanol/Wasser-Gemisch, gefolgt von HPLC mit Massenspektrometrie-Detektion, entwickelt, um Crts und andere nicht-polare Substanzen bestimmen zu können. Mit dieser Methode kann eine große Anzahl von Proben, wie es in systembiologischen Studien üblich ist, extrahiert werden. Es konnten 18 Crts, 4 Chinone, BChla und Bakteriophäophytin a, sowie 4 verschiedene Phosphatidylglycerol Spezies nachgewiesen werden. Die hoch-aufgelösten Time Course Messungen der Crt Biosynthese erlaubten uns die Umwandlungsrate jeder carotinogenen Reaktion zu untersuchen. Ein starker Flaschenhalseffekt wurde bei den CrtD vermittelten Reaktionen beobachtet. Außerdem sind die zweiten Reaktionen aller Enzyme signifikant langsamer als ihre ersten. Die Analyse der Crt-Dynamik deutete darauf hin, dass verschiedene parallele Crt Pathways an gemeinsamen Verbindungspunkten (hydroxylierte Crts) miteinander verlinkt werden können. Durch die niedrige Sauerstoffkonzentration wurde die Crt Biosynthese stärker beeinflusst als das Profil des Zentralstoffwechsels. Die Crt-Mutanten waren sehr sauerstoffempfindlich, was in SLYC18 zu gehemmtem Wachstum und einem 33 %igem Rückgang der anaeroben Crt-Produktion führte. Im Wildtyp wurde in Anwesenheit von Sauerstoff die carotinogene Reaktionssequenz blockiert, was zur Akkumulation von Anhydrorhodovibrin, anstelle des normalen Haupt-Crts Spirilloxanthin, führte. Die Anwesenheit von Sauerstoff beeinflusste die CrtD Aktivität deutlich, was zum Auftreten zweier neuer Seitenwege, die dieses Enzym nicht verwenden, führte: der alternative Spheroiden Stoffwechselweg (4%) im Wildtyp und ST4 und der 3,4-Didehydrolycopin Stoffwechselweg (6%) in ST4. Die Existenz des 3,4-Didehydrolycopin Weges, der bislang in R. rubrum nie beobachtet worden ist, zeigte die Fähigkeit von CrtI zur Katalyse von fünf Desaturierungsschritten in der ST4 Mutante in Anwesenheit von O2. Die PM Biosynthese zeigte eine starke Abhängigkeit von den Änderungen des [UQ]/[UQH2] Verhältnisses. Unter anaeroben Bedingungen ist der Stoffwechsel sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff-Pulsen, die den oxidativen Tricarboxylsäure-Zyklus, die Elektronentransportkette und den UQ Pool Redoxzustand beeinflussen. Analyse des beobachteten Oszillationsmusters mittels systembiologischer Methoden zeigte, dass die Isoprenoide durch ein exogenes Signal (eventuell [UQ]/[UQH2]) reguliert werden.