Array-basierte Identifizierung humanpathogener Schimmel- und Hefepilze für die klinische Diagnostik

Abstract

Die Zahl der invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten nahm in den letzten Jahren stetig zu. Betroffen sind u.a. Frühgeborene, Krebs- und AIDS-Patienten, Transplantierte sowie Mukoviszidose-Patienten. Zeitintensive Diagnostikmethoden in den klinischen Laboratorien können bei invasiven fungalen Infektionen zu hohen Mortalitätsraten der betroffenen Patienten führen. Diese Methoden beruhen auf Kultivierungen der Patientenproben sowie morphologischen und physiologischen Tests. Empirische Therapien ohne klare Diagnose bergen neben Unwirksamkeiten und Resistenzentwicklungen auch die Gefahr massiver Nebenwirkungen, die den Zustand der Patienten verschlechtern können. Bei fungalen Infektionen kann die Kultivierungszeit der Patientenproben bis zu einem eindeutig positiven oder negativen Ergebnis, Tage und sogar Wochen in Anspruch nehmen. Durch eine zeitnahe und adäquate Medikation infolge einer schnellen und speziesspezifischen Identifizierung direkt aus der Patientenprobe könnte die Lebenserwartung der Patienten erhöht werden. Dies bedarf einer sensitiven Identifizierungsmethode, die selbst sehr geringe Zellzahlen auf Spezieseben nachzuweisen vermag. In dieser Arbeit wurde ein PCR-Array-System basierend auf konservierten und variablen Sequenzen der Internal transcribed spacer Region des ribosomalen Clusters für den Nachweis humanpathogener Pilze etabliert. Durch den Einsatz panfungaler Primer in der etablierten ITS-Nested-PCR konnte eine Mindestmenge von zehn fungalen DNA-Molekülen bei hohem humanem DNA-Hintergrund zuverlässig amplifiziert werden. Von insgesamt 566 entwickelten DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden 96 ITS-Sonden ausgewählt. Diese erlaubten eine simultane Überprüfung der amplifizierten ITS-Region auf 56 humanpathogene fungale Spezies. Das etablierte finale PCR-Array-System wurde mit fungaler Referenz-DNA bei humanem DNA-Hintergrund evaluiert. Bei 64 % der hybridisierten Spezies waren ausschließlich Signale auf den zugehörigen 30 Antisense-Sonden für diese Spezies zu verzeichnen. 36% der hybridisierten Spezies führten neben speziesspezifischen Signalen zudem zu Signalen auf Sonden, die nicht der hybridisierten Spezies zuzuordnen waren. Allerdings wiesen die unspezifischen Sondensignale hauptsächlich Intensitäten nahe des Detektionsschwellenwertes auf. Die statistische Bewertung des PCR-Array-Systems wies eine Richtig-Positiv-Rate von 100 % und eine Richtig-Negativ-Rate von 99 % für Einzelspezies-Hybridisierungen auf. Durch eine Zwei-Sonden-Diskriminierung, die bei monomikrobiellen Infektionen herangezogen werden könnte, ist bei diesen Spezies jedoch eine eindeutige Diskriminierung möglich. Die Evaluierung des Systems mit DNA aus Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages zeigte, dass diese Unspezifitäten Spezies betraf, die für das untersuchte Probenmaterial klinisch weniger relevant waren wie bspw. Dermatophyten. Klinisch für die untersuchten Probenmaterialen relevantere Spezies wie Candida albicans und Nicht-albicans Candida Spezies konnten anhand spezifischer Sonden eindeutig identifiziert werden, wobei im Fall von Nicht-albicans Candida Spezies eine spezifischere Klassifizierung möglich war, als durch in der klinischen Diagnostik aktuell angewandte mikrobiologische Methoden. Bei 102 Patientenproben - Trachealsekreten und Bronchoalveolären Lavages - stimmte das Ergebnis des PCR-Array-Systems mit den mikrobiologische Befunden überein. Für 23 Proben konnte der mikrobiologische Befund durch die Ergebnisse des Systems erweitert werden. Bei weiteren 23 Proben wurden, mittels des entwickelten PCR-Array-Systems, weniger Spezies als durch mikrobiologische Methoden identifiziert. Lediglich bei drei Proben wurden komplett abweichende Array-Befunde erzielt.Beginnend mit der DNA-Isolierung der Patientenproben ist durch das in dieser Arbeit etablierte PCR-Array-System eine speziesspezifische Identifizierung und adäquate Medikation der Patienten innerhalb weniger Stunden realisierbar und würde zu einer erhöhten Überlebenschance dieser beitragen.

The number of invasive fungal infections of immunocompromised patients increased steadily in recent years. Neonates, cancer and AIDS patients, transplant and cystic fibrosis patients are most commonly affected. Due to time-consuming diagnostic methods in clinical laboratories invasive fungal infections are associated with high mortality rates. These methods are based on morphological and physiological tests of cultivated patient samples. This identification process can take a few days up to several weeks, which mandates empirical therapies to be conducted. This can lead to inefficient therapy, the development of resistance to antimycotics and the risk of massive side effects resulting in a worsened health situation of the patients. Through a species-specific, timely and adequate medication the patient’s life expectancy can be increased significantly. This, however, requires a sensitive identification method which allows the detection and identification of even a small number of fungal cells at the species level. In this study, a PCR-Array-System based on conserved and variable sequences of the internal transcribed spacer region of the ribosomal cluster for the detection of human pathogenic fungi is developed. By using panfungal primers for the amplification of the fungal ITS region via a Nested-PCR approach, a minimum of ten fungal DNA molecules within a high human DNA background could be amplified reliably. For identification, 96 ITS oligonucleotide probes were shown to be most discriminating out of a total of 556 developed DNA oligonucleotide probes. This DNA microarray allows the simultaneous screening of the amplified ITS regions on 56 human pathogenic fungal species. The established PCR-Array-System was evaluated with fungal reference DNA samples within a human DNA background situation. For 64 % of the hybridized species signals could be identified by a single probe reaction. For 36 % of the hybridized species, species-specific signals could be observed next to signals that were not matching the hybridized species. However, those non-specific probe signals showed mainly intensities close to the detection threshold. For monomicrobial infections, a clear discrimination is still possible by a double-probe-discrimination. The statistical evaluation of the final PCR-Array-System had a true positive rate of 100 % and a specificity of 99 % for single-species hybridizations. The evaluation of the PCR-Array-System with DNA from tracheal secretions and bronchoalveolar lavages has shown that these unspecific signals relate to species that are clinically less relevant for the applied probe material like dermatophytes. Clinically relevant species such as Candida albicans and non-albicans Candida species could be clearly identified using the specific probes established in this work. Even for non-albicans Candida species a more specific classification compared to currently applied microbiological methods in clinics is possible. The results of the PCR-Array-Systems of 53 of 102 patient samples - tracheal secretion and bronchoalveolar lavages - concur with the results of the microbiological results. For 23 samples the microbiological results could be extented via the established PCR- Array-Systems and also for 23 samples less species than with microbiological methods could be identified. Only three samples showed completely different results. Starting with the isolation of DNA of the patient samples a species-specific identification and adequate medication within a few hours can be realized by the PCR-Array-System established in this work. This would result in an increased life expectancy of the patient.