Development and application of experimental tools for studying the distribution and dynamics of chromatin modifications

Abstract

All cells in a multicellular organism carry the same genetic information, and yet throughout their lifetimes they follow unique transcriptional programs, which lead to phenotypical and functional differences. These differential gene expression programs are enacted by highly coordinated epigenetic mechanisms, which include modifications of chromatin, such as DNA methylation and histone post-translational modifications. Their involvement in chromatin-associated processes, association with different genomic elements and the means of their establishment and maintenance are crucial scientific issues. The primary focus of this study was to shed light on the genome-wide distribution of chromatin modifications and the effects of their local establishment. First, we focused our efforts into developing and applying novel affinity reagents for local and genome-wide characterization of histone modifications. We made use of native and engineered recombinant proteins that have an intrinsic ability to interact specifically with modified histones. In a rigorous side-by-side comparison with high quality histone modification antibodies, we successfully applied these novel affinity reagents in approaches such as western blot and chromatin precipitation coupled with quantitative PCR or massively parallel sequencing, following established quality control criteria. By this, we validated the feasibility of this strategy. We also discussed in detail the advantages of using recombinant proteins in lieu of antibodies, such as their cheap production with high yield, ease of protein engineering and consistent quality and reproducibility. Secondly, we wanted to clarify some of the principal mechanisms by which epigenetic modifications operate inside the cell. To this aim, we established and applied an approach based on zinc finger targeted promoter methylation of VEGF-A (vascular endothelial growth factor) in order to study the in vivo effects and dynamics of histone modifications and DNA methylation. Adenoviral constructs made of the targeting zinc finger were fused with catalytic domains from epigenetic enzymes such as DNA and histone methyltransferases and were used to infect cells. By these means we were able to successfully follow in detail the establishment, effects and kinetics of the installed chromatin modifications. Our data indicate that local chromatin editing of a target locus can change its intial chromatin state and consequently modulate its transcriptional output, albeit for a short period of time, before it returns to its native configuration. In conclusion, in this body of work we were able to successfully develop and apply novel affinity reagents for studying the distribution of histone modifications. Along the same lines, we also successfully developed and applied a strategy for targeted chromatin editing, which allowed us to study the dynamics of establishment, downstream effects and maintenance of chromatin modifications.

Alle Zellen eines Organismus tragen dieselbe genetische Information und folgen dennoch im Laufe ihrer Entwicklung einem eigenen transkriptionellen Programm, aus dem phänotypische und funktionelle Unterschiede resultieren. Diese unterschiedlichen Genexpressionprogramme werden durch epigenetische Mechanismen kontrolliert, welche Chromatinmodifikationen wie DNA Methylierung und posttranslationale Histonmodifikationen beinhalten. Der Einfluss von posttranslationalen Chromatinmodifikationen auf Chromatin assoziierte Prozesse, ihre Assoziation mit verschiedenen genomischen Elementen und die Bedeutung ihrer Etablierung und Erhaltung sind von großem wissenschaftlichen Interesse. Der primäre Fokus dieser Arbeit lag auf der Analyse der genomweiten Verteilung von Chromatinmodifikationen sowie deren lokalen Auswirkungen. Der erste Teil dieser Arbeit behandelt die Entwicklung und Anwendung neuer affinitätsbasierter Reagenzien für die lokale und genomweite Charakterisierung von Histonmodifikationen. Dafür verwendeten wir native und speziell weiterentwickelte rekombinante Proteine, die als natürliche Eigenschaft eine spezifischen Interaktion mit modifizierten Histonen aufweisen. Durch einen präzisen Vergleich mit qualitativ hochwertigen Antikörpern gerichtet gegen dieselben Histonmodifikationen, konnten wir erfolgreich die Funktionalität dieser neuen affinitätsbasierten Reagenzien in Methoden wie dem Western Blot und der Chromatinpräzipitation gekoppelt mit quantitativer PCR oder Next Generation Sequenzierung nach etablierten Kriterien der Qualitätskontrolle überprüfen und aufzeigen. Die entwickelten rekombinanten Affinitätsreagenzien besitzen zudem im Vergleich zu Antikörpern die Vorteile von geringen Produktionskosten in Kombination mit hoher Ausbeute, die Möglichkeit der simplen Modifikation und eine gleichbleibende Qualität, welche vor allem die Reproduzierbarkeit von Daten verbessert. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung des Grundmechanismus, mit dem epigenetische Modifikationen auf die Zellentwicklung Einfluss nehmen. Um die Effekte und die Dynamik von Histonmodifikationen und der DNA Methylierung in situ zu studieren, etablierten wir ein Protokoll zur gezielten Promotormethylierung von VEGF-A (Vaskularer endothelialer Wachstumsfaktor A). Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit einem adenoviralen Vektor infiziert, der für einen Target-Zinkfinger fusioniert mit der katalytischen Domäne eines epigentischern Enzymes wie DNA- oder Histonmethyltransferasen kodiert. Die Etablierung, der lokale Effekt und die Kinetik der eingeführten Chromatinmodifikationen konnten im Detail verfolgt werden. Unsere Daten zeigen, dass lokales Editieren eines Ziellokus seinen initialen Chromatinstatus verändern und als Konsequenz die Transkription modifizieren kann. Der Effekt überdauert jedoch nur eine kurze Zeit, bevor der Chromatinstatus in seinen nativen Zustand zurückfällt. Zusammenfassend wurden während dieser Arbeit neue, affinitätsbasierte Reagenzien zur Analyse der genomischen Verteilung von Histonmodifikationen erfolgreich entwickelt und angewendet. Nach einem ähnlichen Schema wurde eine Strategie zur gezielten Chromatinmodifizierung entwickelt und angewendet, die es erlaubt die Dynamik, den induzierten Effekt und die Aufrechterhaltung von Chromatinmodifizierungen zu studieren.