Analysis of SNAREs, Arf1p and regulators in intracellular transport

Abstract

Vesicular transport is an essential process allowing communication between different organelles in an eukaryotic cell. The small GTPase Arf1p regulates the generation of coated vesicles from donor organelles at many different levels of the secretory pathway. Arf1p cooperates with GTPase-activating proteins (GAPs) to hydrolyze the bound GTP, which subsequently induces the shedding of the proteinacious vesicle coat. Only then the vesicle is capable to undergo SNARE-mediated (soluble NSF attachment protein receptor) fusion with a target organelle to deliver its content. Previously, our lab showed that ArfGAPs can catalytically induce an altered conformation in vesicle SNARE proteins (v-SNAREs). The SNARE in the altered conformation is able to interact with Arf1p. Thus, the uptake of v-SNAREs in budding vesicles is facilitated. The current study extends the previous results to target membrane SNAREs (t-SNAREs) and shows that the ArfGAP-induced conformation enhances the formation of SNARE complexes. SNARE complex formation is an essential step during membrane fusion. Thus, the altered SNARE conformation is not only important during vesicle generation, but also for the consumption of transport vesicles. This let us speculate that ArfGAP proteins might act in a chaperone-like function on SNARE proteins. We were also able to show that SNARE proteins in the ArfGAP-induced SNARE conformation can interact with Sec17p and Sec18p, the yeast homologs of alpha-SNAP (soluble NSF attachment protein) and AAA-ATPase NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor). Both factors play a key role in membrane fusion by resolving cis-SNARE complexes. Data from this study indicate that the ATPase Sec18p has a second function during vesicle fusion as it can displace Arf1p from SNAREs. This process requires neither ATP-hydrolysis nor Sec18p´s co-factor Sec17p. Residual coat on the vesicle could still be required during an initial contact between the two fusing membranes. However, it would likely obstruct the final fusion event. Thus, Sec18p might be able to remove residual coat from a vesicle and allow final fusion to take place. After one round of vesicle fusion, v-SNAREs are recycled back to the donor compartment. Data presented in this study show that Snc1p and Snc2p, which are v-SNAREs involved in yeast exo- and endocytosis, interact physically and genetically with the ArfGAP Gcs1p, and that this interaction is essential for recycling of SNAREs via the trans-Golgi-Network (TGN) and endosomes. Furthermore, we were able to show that the COPI vesicle coat, which has been implicated in retrograde trafficking from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum (ER) as well as in retrograde traffic within the Golgi apparatus, plays also an important role in the recycling of the post-Golgi SNAREs Snc1p and Snc2p. Besides Arf1p´s role in the formation of retrograde directed vesicles, Arf1p also participates in anterograde trafficking from the TGN, which is thought to be the main sorting station for anterograde cargo in an eukaryotic cell. In an attempt to identify new interactors of the small GTPase Arf1p, we found a novel fungi-specific protein family: the ChAPs (for Chs5p and Arf1p-interacting proteins). The ChAP family of proteins consists out of four members: Bch1p, Bch2p, Chs6p and Bud7p. These factors at least partially localize to the TGN, dependent on their interaction with Chs5p. Chs5p has been previously reported to be essential for the delivery of chitin-synthase III (Chs3p) to the yeast bud neck-region; a process Arf1p is also implicated in. We are able to show that Arf1p, Chs5p and individual members of the ChAP family interact genetically and physically. Arf1p, Chs5p and the ChAP proteins form high molecular complexes that contain the potential cargo Chs3p. Based on our findings, we suggest that the ChAP proteins are required for the transport of certain cargo in specialized transport vesicles. The ChAPs might function as cargo receptors, coat adaptors or even as novel coat. Altogether, this work has highlighted new interactors for the small GTPase Arf1p and new modes of function for its regulatory GAP proteins.

Für die Kommunikation zwischen den einzelnen Organellen, die das Überleben einer eukaryotischen Zelle sichert, ist der Vesikeltransport unbedingt notwendig. Bei vielen Schritten innerhalb des sekretorischen Weges ist die kleine GTPase Arf1p ein wichtiger Regulator; z.B. bei der Bildung von Protein-umhüllten Vesikeln von einem Organell innerhalb des sekretorischen Weges. Damit ein Vesikel mit einer Akzeptororganelle verschmelzen und seine Fracht abliefern kann, muß sich die Proteinhülle vom Vesikel lösen. Dies wird durch GTP-Hydrolyse durch Arf1p bewerkstelligt. Hierfür benötigt Arf1p die Hilfe von ArfGAPs, die die GTPase Aktivität von Arf1p erhöhen (GTPase activating proteins). SNARE Proteine (soluble NSF attachment protein receptors) auf Vesikel- (v-SNAREs) und Akzeptormembran (t-SNAREs) bilden trans-Komplexe, die beide Membranen zusammenführen können. Schließlich können Vesikel- und Akzeptormembran verschmelzen. Frühere Ergebnisse aus unserem Labor haben gezeigt, dass ArfGAPs katalytisch eine Konformationsänderung in v-SNARE Proteinen hervorrufen können. In der aktivierten Konformation kann das v-SNARE mit Arf1p wechselwirken, was dazu führt, dass SNAREs effizient in neu entstehende Transportvesikel integriert werden. Daten aus der vorliegenden Arbeit belegen, dass ArfGAPs die aktivierte Konformation auch in t-SNAREs hervorrufen kann. Da die aktivierte Konformation die SNARE-Komplexbildung begünstigt, spielt sie nicht nur für den Einbau von SNAREs in neu entstehende Vesikel, sondern auch während des Verschmelzens des Vesikels mit der Akzeptormembran eine große Rolle. Basierend hierauf, vermuten wir, dass ArfGAPs auf SNAREs ähnlich wie Chaperone wirken könnten, indem sie die Faltung von SNAREs positiv beeinflussen. SNAREs in der aktivierten Konformation sind außerdem in der Lage mit Sec17p und der AAA-ATPase Sec18p, den in der Hefe homologen Proteinen von alpha-SNAP (soluble NSF attachment protein) und NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor), zu interagieren. Sec17p und Sec18p spielen bei der Membranfusion eine Schlüsselrolle, da sie cis-SNARE-Komplexe, die Überreste von vorhergehenden Membranfusionen in der Akzeptormembran sind, auflösen können. Hierfür ist ATP-Hydrolyse durch die ATPase Sec18p essentiell. Für ein anfängliches Erkennen von Vesikel- und Akzeptormembran sind Überreste der Vesikelhülle eventuell noch notwendig, dennoch würden diese Reste den eigentlichen Membranfusionsprozess behindern. Hier können wir eine zweite Funktion von Sec18p zeigen, die unabhängig von der ATP-Hydrolyse und dem Co-Faktor Sec17p ist: Sec18p kann verbliebenes Arf1p von SNARE Proteinen verdrängen. Aufgrund dieser Funktion kann der Fusionsprozess stattfinden. v-SNARE Proteine werden nach einer Vesikelfusion zum Ausgangskompartiment zurücktransportiert. Resultate dieser Arbeit zeigen, dass das ArfGAP Gcs1p mit den SNARE Proteinen Snc1p und Snc2p, die an der Exo- und Endozytose in Hefe beteiligt sind, genetisch und physikalisch wechselwirken kann. Diese Interaktion ist für das Recycling, das über das trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und die Endosomen abläuft, unbedingt notwendig. Transportvesikel, die von einer COPI Proteinhülle umgeben sind, spielen ihre Hauptrolle im Pendelverkehr zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi Apparat sowie im retrograden Transport innerhalb des Golgi Apparats. Wir konnten jedoch zeigen, dass COPI-umhüllte Vesikel auch für das Recycling der Snc v-SNAREs im post-Golgi Transport eine wichtige Rolle spielen. Das trans-Golgi-Netzwerk ist die wichtigste Verteilstation für vorwärts transportierte Proteine. Die kleine GTPase Arf1p ist auch an Vesikeltransportvorgängen beteiligt, die vom TGN ausgehen. Im Bestreben neue Interaktoren von Arf1p zu finden, konnten wir eine bislang unerforschte pilz-spezifische Proteinfamilie identifizieren: die ChAPs (Chs5p and Arf1p-interacting proteins). Diese Proteinfamilie hat vier Mitglieder: Bch1p, Bch2p, Chs6p and Bud7p. Alle vier Proteine sind zumindest teilweise am TGN lokalisiert; hierfür ist die Interaktion mit Chs5p notwendig. Schon früher konnte gezeigt werden, dass Chs5p für den Transport des Enzyms Chitin Synthase III (Chs3p) and den Knospungshals in Hefe essentiell ist; ein Prozess in den auch Arf1p involviert ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arf1p, Chs5p und einzelne Mitglieder der ChAP Familie genetisch und physikalisch interagieren und am Transport von Chs3p zur Plasmamembran beteiligt sind. Arf1p, Chs5p und die ChAPs befinden sich höhermolekularen Komplexen, die außerdem Chs3p, als mögliche Fracht von spezialisierten Transportvesikeln enthalten. Bei der Bildung dieser Transportvesikel am TGN könnten die ChAPs als Frachtrezeptoren, als Adapter für eine Proteinhülle oder sogar selbst als Proteinhülle für Transportvesikel fungieren. Zusammengefaßt stellt diese Arbeit neue Interaktoren für die kleine GTPase Arf1p, sowie neue Funktionen für die regulatorischen Proteine von Arf1p, den ArfGAPs, vor.