Computergestützte Untersuchungen zur Dynamik und Wasserbindung des omega-loops in TEM beta-Lactamasen

Abstract

Die Enzyme der TEM ß-Lactamasen stellen in gramnegativen Bakterien die Hauptursache für die Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika dar. Der Omega-loop ist ein in allen Klasse A ß-Lactamasen konserviertes Strukturelement und positioniert eine für den Reaktionsmechanismus essentielle Aminosäure. Der Omega-loop ist durch eine Salzbrücke zwischen den Aminosäuren Arg164 und Asp179 in seiner Form fixiert. Der Grad seiner Flexibilität ist jedoch auf Grund teils widersprüchlicher Ergebnisse bisheriger Untersuchungen unklar. Da bekannt ist, dass Wasser einen großen Einfluss auf die Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen hat, wurde in dieser Arbeit mit computergestützten Methoden der Zusammenhang zwischen der Wasserbindung und der Dynamik des Omega-loops untersucht. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit an der Automatisierung von multiplen molekulardynamischen Simulationen in Cluster- und Grid-Umgebungen sowie an neuen Methoden zur Analyse der Proteindynamik mitgearbeitet. Die Kristallwassermoleküle aus 49 hochaufgelösten Röntgenkristallstrukturen der ß-Lactamase-Familien TEM, SHV und CTX-M wurden einer Cluster-Analyse unterzogen, um Aussagen über konservierte Wassermoleküle in Klasse A ß-Lactamasen treffen zu können. Es wurden insgesamt 13 Wassermoleküle identifiziert, welche in mehr als 90% der 49 Strukturen konserviert waren; darunter auch zwei zu 100% konservierte Wassermoleküle. Sechs der insgesamt 13 konservierten Wassermoleküle waren am Omega-loop lokalisiert, drei weitere konservierte Wassermoleküle waren mit anderen loop-Elementen in der Proteinstruktur assoziiert. Die am Omega-loop lokalisierten Wassermoleküle befanden sich in einer Aushöhlung, welche der Omega-loop mit den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns formt. Diese konservierten Wassermoleküle ermöglichen die Ausbildung eines Wasserstoffbrückennetzwerks zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und denen des Proteinkerns und stabilisieren somit den Omega-loop. Um die Dynamik und Flexibilität des Omega-loops näher zu charakterisieren und den Einfluss der konservierten Wassermoleküle darauf zu untersuchen, wurden multiple molekulardynamische Simulationen der TEM ß-Lactamase in Wasser als explizitem Lösungsmittel durchgeführt. Es zeigte sich, dass die TEM ß-Lactamase ein hoch geordnetes und rigides Protein ist, dass nur in loop-Bereichen eine erhöhte Flexibilität aufweist. Während der Hauptteil des Omega-loops eine geringe Flexibilität aufweist, sind die Aminosäuren 173 bis 177 durch eine erhöhte Flexibilität gekennzeichnet. Dieses kurze Teilstück des Omega-loops zeigte eine deutliche Bewegung, die einem ¨Offnen und Schließen der Aushöhlung am Omega-loop entspricht. Durch die Kombination mehrerer Simulationen konnte auch gezeigt werden, dass die Ergebnisse früherer Arbeiten über die Flexibilität des Omega-loops keinesfalls im Widerspruch zueinander stehen, sondern jeweils nur unterschiedliche Teilschritte der Omega-loop Bewegung beschreiben, deren Gesamtdauer über die einer einzelnen Simulation hinausgeht. Für vier der sechs in der Kristallstrukturanalyse identifizierten konservierten Wassermoleküle konnte in den multiplen Simulationen reproduzierbar gezeigt werden, dass sie Wasserbrücken zwischen den Aminosäuren des Omega-loops und den gegenüberliegenden Aminosäuren des Proteinkerns ausbilden. Die Aminosäuren 173 bis 177 sind jedoch nicht an der Ausbildung dieser Wasserbrücken beteiligt, was ihre erhöhte Flexibilität erklärt. Die Durchführung multipler Simulationen stellt eine logistische Herausforderung in Bezug auf die Vorbereitung, Durchführung und Auswertung der zahlreichen Simulationen dar, die nur noch sehr schwer von Hand zu bewältigen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher in Zusammenarbeit mit dem Höchstleistungsrechenzentrum der Universität Stuttgart der gesamte Ablauf einer multiplen molekulardynamischen Simulation in ein System zur automatisierten Durchführung wissenschaftlicher Arbeitsabläufe implementiert und erfolgreich in einer Grid-Umgebung getestet. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Visualisierung und Interaktive Systeme der Universität Stuttgart wurde daher eine neuartige Methode zur haptischen Interaktion und Analyse von molekulardynamischen Simulationen entwickelt. Hierzu wurde ein haptisches Eingabegerät, dass Bewegungen in sechs Freiheitsgraden ermöglicht und über einen stiftähnlichen Griff bedient wird, mit einem Visualisierungsprogramm für molekulardynamische Simulationen gekoppelt. Dieser Ansatz ermöglicht durch das Zuweisen von Oberflächeneigenschaften an die betrachtete Proteinstruktur die Übermittlung zusätzliche Informationen. Zudem ist es möglich, über das haptische Eingabegerät direkt mit der Proteinstruktur zu interagieren und somit die Proteindynamik im Verlauf einer molekulardynamischen Simulation interaktiv und zeitabhängig zu analysieren.

The production of TEM ß-lactamases is the main course for resistance against ß-lactam antibiotics in gram-negative bacteria. The omega-loop is a conserved structural element in all class A TEM ß-lactamases and is directly involved in the catalytic reaction of the enzymes because it positions an essential amino acid. It is located at the surface of the enzyme and it’s conformation is anchored by a conserved salt bridge formed between Arg164 and Asp179. However, the flexibility of the omega-loop is still under debate, as previous studies led to contradictory results. Because water plays an important role in protein structure, function and dynamics, in this work the interplay between water binding and the dynamics at the omega-loop was investigated using computational methods. Further, in this work tools for efficiently performing multiple molecular dynamics simulations in cluster and grid environments as well as novel methods for analyzing protein dynamics have been co-developed. Crystal water molecules from 49 high-resolution X-ray structures of the TEM, SHV, and CTX-M class A ß-lactamase families were systematically analyzed using a clustering based approach to identify conserved water molecules in class A ß-lactamases. Overall, 13 water molecules were found to be conserved in at least 90% of the 49 structures, including two water positions which were found to be conserved in all structures. From the 13 conserved water molecules, six are located inside a cavity lined by the omega-loop and residues of the protein core. Forming a dense hydrogen bond network between those residues, this layer of conserved water molecules thus stabilizes the omega-loop. Three additional conserved water molecules were associated with other loop regions in the protein structure. Further, the evolutionary relationship between the three families derived from the number of conserved water molecules is similar to the relationship derived from phylogenetic analysis. Multiple molecular dynamics simulations of the TEM ß-lactamase in explicit water were performed and analyzed to investigate the dynamics of the omega-loop and its interplay with bound water molecules. Using multiple simulations allows a more efficient sampling of the proteins conformational space and was used to estimate the reproducibility and significance of the results. The analysis of protein flexibility showed that the TEM-1 ß-lactamase is a very compact and rigid protein with highly ordered secondary structure elements and slightly less ordered loop regions. However, while the main part of omega-loop is rigid, residues 173 to 177 exhibited a considerably higher flexibility. These residues perform a motion that resembles an opening and closing movement of the omega-loop cavity. By using multiple molecular dynamics simulations the results of two previous studies, which at first seemed to be contradictory, could be explained: They both described parts of a motion, which occurs on a time scale that was not accessible in a single simulation. Stabilizing water bridges, mediated by four of the six conserved water molecules identified in the crystal structure analysis, were repeatedly shown to occur inside the omega-loop cavity, explaining the heterogeneous distribution of flexibility at the omega-loop. While the main part is stabilized towards the protein core by the water bridges, the residues 173 to 177 lack these interactions and thus show an increased flexibility. Multiple molecular dynamics simulations of proteins require extensive computational power and run on large PC clusters or in a grid environment. The tasks of preparing, running and analyzing of multiple simulations can no longer be performed interactively and therefore have to be automated. In cooperation with the High Performance Computing Center Stuttgart at the University of Stuttgart, the procedure of a multiple molecular dynamics simulation experiment was implemented in a system for scientific workflows and successfully tested in a grid environment. In cooperation with the Visualization and Interactive Systems Group at the University of Stuttgart a novel method for haptic interaction and analysis of molecular dynamics trajectories was therefore developed. A haptic device, which is operated via a pencil-like handhold and that allows movements in six degrees of freedom, was integrated into a molecular dynamics trajectory viewer. This approach allows transmitting of additional information by mapping surface properties such as roughness or smoothness onto the protein structure. Additionally, it is now possible to directly interact with the protein during the course of the molecular dynamics simulation and to interactively investigate the protein dynamics. 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